葉瓊仙，劉 靜，苗愛(ài)清，王冬梅，*

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東英德513000）

“白葉單樅”茶是廣東省特色茶品種資源，也叫嶺頭單樅茶，屬于喬木型大葉類，含有豐富的茶多酚[1]，在廣東省種植面積近萬(wàn)頃。白葉單樅茶可加工為烏龍茶、紅茶、黑茶等，其加工的黑茶陳香濃郁略帶藥香，滋味濃厚，品質(zhì)風(fēng)格獨(dú)特，與云南普洱茶品質(zhì)相當(dāng)[2]。白葉單樅黑茶的加工過(guò)程是其品質(zhì)形成的關(guān)鍵，其中“渥堆”是加工過(guò)程中的特殊工藝，實(shí)質(zhì)是以微生物的活動(dòng)為中心，通過(guò)胞外酶、微生物自身物質(zhì)的協(xié)同作用，使茶葉內(nèi)含物發(fā)生極為復(fù)雜的變化，形成黑茶特殊的品質(zhì)風(fēng)味[3]。

黑茶具有顯著的抗氧化、降血糖血脂的保健作用，張冬英等[4]利用高通量篩選法尋找普洱茶具有降血糖血脂作用的活性成分，發(fā)現(xiàn)普洱茶醇提物對(duì)PPARδ受體有激活作用，有潛在的降血糖血脂作用。近期研究[5]表明，普洱茶水提物可降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖水平，與降血糖陽(yáng)性藥阿卡波糖的活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性。大量研究表明[6-7]，糖尿病病人機(jī)體中自由基產(chǎn)生與清除能力是不平衡的，處于氧化應(yīng)激的狀態(tài)，而持續(xù)產(chǎn)生的自由基和抗氧化防御系統(tǒng)缺陷可能介導(dǎo)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病與惡化進(jìn)程。由于黑茶中抗氧化活性、降血糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明晰，本文利用DPPH法、FRAP法及α-胰淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制活性分別評(píng)價(jià)黑茶的抗氧化活性及體外降血糖活性，并對(duì)活性最強(qiáng)的部位進(jìn)行HPLC-DAD-MS成分分析，以期為闡明黑茶降血糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)、并為將黑茶開發(fā)成具有降血糖功效的保健食品或藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白葉單樅黑茶樣品 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所制備；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.2）、4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；TPTZ（2，4，6-tripyridy-s-triazine，2，4，6-三吡啶-三吖嗪）、DPPH·（1，1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、α-胰淀粉酶（porcine pancreaticα-amylase，EC 3.2.1.1）、蘆?。≧utin） 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖（Acarbose） 拜耳醫(yī)藥保健公司；HPLC分析用乙腈 為色譜純?nèi)軇?，美?guó)TEDIA；其他試劑 均為市售分析純。

TSQ Quantum液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC系統(tǒng)包括P4000四元泵、UV 6000LP二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、電噴霧電離（ESI）離子源） 美國(guó)Thermo Quest Finnigan公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AG285萬(wàn)分之一電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白葉單樅黑茶的提取與不同極性溶劑萃取 黑茶樣品1kg，加入8倍量（W/V）的60%乙醇溶液超聲提取1h，過(guò)濾，將濾液減壓濃縮至小體積（約1.0L），得黑茶60%乙醇提取物（以下簡(jiǎn)稱黑茶醇提物），后依次用氯仿、乙酸乙酯及正丁醇進(jìn)行萃取，萃取液揮干溶劑后得氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水層留余物，各干燥萃取物重量分別為：22.31、1.78、3.26、33.32g。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[8]并作適當(dāng)調(diào)整，精密稱取105℃下干燥恒重的蘆丁對(duì)照品適量，用50%的乙醇溶解，定容，配制為0.1g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0m L于25m L的比色管中，加入8m L 1.5%A lCl3和4m L醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH 5.5），并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置30min后于415nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以顯色液中蘆丁的質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=1.1169x-0.0134，相關(guān)系數(shù)R2為0.9995。以上述操作方法測(cè)定2.0m L樣品溶液于415nm波長(zhǎng)下吸光度值，并將吸光度值代入上述回歸方程中計(jì)算黑茶提取物及各萃取物中總黃酮含量，以蘆丁當(dāng)量（mg RE/g）來(lái)表示。

1.2.3 總酚含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[9]，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.042x-0.0475，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999，測(cè)定黑茶多酚聚合物的總酚含量。2.0m L一定濃度的樣品溶液與1.0m L Folin-Ciocalteau顯色劑混合，充分振蕩后靜置3～4m in，再加入1.0m L 10%Na2CO3溶液，搖勻后于室溫下避光顯色30m in，測(cè)定780nm波長(zhǎng)處的吸光度值，并計(jì)算樣品中總酚的含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，并以沒(méi)食子酸當(dāng)量（mg GAE/g）計(jì)算黑茶樣品的總酚含量。

1.2.4 DPPH·清除活性測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[10]并做適當(dāng)調(diào)整，精密稱取黑茶各樣品0.01000g，用95%乙醇配制成1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/m L 5種濃度的樣品溶液，備用。精密量取2.0m L 95%乙醇，加入2.0m L 200μmol/m L DPPH·溶液（溶于95%乙醇），再加入1.0m L樣品溶液，充分混合，避光反應(yīng)30m in后在517nm處測(cè)定其吸光度As。各待測(cè)物對(duì)DPPH·的清除率P可用下式計(jì)算：

式中，As為2.0m L 95%乙醇+2.0m L DPPH·溶液+1.0m L樣品溶液的吸光度；Ar為4.0m L 95%乙醇+1.0m L樣品溶液的吸光度；A0為3.0m L 95%乙醇+2.0m L DPPH溶液的吸光度。平行操作6次，并通過(guò)濃度曲線計(jì)算各樣品的EC50。

1.2.5 FRAP（鐵離子還原）法 參照Benzie等[11]的方法。精密稱取TPTZ適量，溶解于40mmol/L HCl溶液，配制濃度為10mmol/L的TPTZ溶液，備用。精密稱取FeCl3·6H2O適量，蒸餾水溶解并配制濃度為20mmol/L的FeCl3溶液，備用。將300mmol/L pH 3.6乙酸鹽緩沖溶液、10mmol/L TPTZ溶液與20mmol/L FeCl3溶液以體積比10∶1∶1充分混合配制為FRAP試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

取2.0m L 0.2mg/m L樣品溶液加入3.0m L FRAP試劑，混合后在37℃下反應(yīng)10min后，測(cè)定593nm處吸光度的增加值。以FeSO4溶液為對(duì)照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=0.006x+0.0641，相關(guān)系數(shù)R2為0.9998。計(jì)算0.2mg/m L濃度下樣品的抗氧化活性（FRAP值），以達(dá)到相同吸光度值所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示，以及當(dāng)量濃度（EC1）相當(dāng)于1.0mmol/L FeSO4還原能力的樣品濃度。

1.2.6 黑茶提取物及各萃取物對(duì)α-胰淀粉酶抑制活性 采用3，5-二硝基水楊酸法[12]測(cè)定黑茶各樣品對(duì)α-胰淀粉酶的抑制活性。取200μL 5mg/m L的樣品溶液（0.2mg樣品溶于NaCl濃度為6mmol/L的20mmol/L pH 6.9的磷酸鈉緩沖液）與200μLα-淀粉酶溶液（1.0U/m L，溶于pH 6.9的磷酸鈉緩沖液）混合，在37℃下孵育10m in后加入400μL 0.25%的淀粉溶液，置于37℃水浴中反應(yīng)10m in后加入1.0m L DNS顯色劑（1% 3，5-二硝基水楊酸、12%酒石酸鉀鈉共同溶于0.4mol/L NaOH）終止反應(yīng)，沸水浴10min后冷卻至室溫，加入10m L蒸餾水稀釋后于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A樣品）。以緩沖液代替酶溶液，保持其他條件不變測(cè)背景吸收（A背景）；含NaCl的緩沖液代替樣品溶液，不改變其他條件作為陰性對(duì)照（A陰性）。用以下公式計(jì)算樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率：

1.2.7 黑茶提取物及各萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性 參考已報(bào)道方法[13]，在96孔板中，20μL的樣品溶液（用20%甲醇水溶液配制為50μg/m L）與40μL 5mmol/L的PNPG（4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）溶液（溶于pH 7.0的磷酸鈉緩沖溶液）在37℃下孵育5m in后，加入10μL 1.0U/m Lα-葡萄糖苷酶溶液（溶于pH7.0的磷酸鈉緩沖溶液），振蕩均勻，37℃下反應(yīng)10m in后加入140μL 0.2mmol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于400nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A樣品），并以緩沖溶液代替酶溶液，保持其他條件不變測(cè)背景吸收（A背景）；以20%甲醇水溶液代替樣品溶液，不改變其他條件作為空白對(duì)照（A空白）。每個(gè)樣品平行6次，用以下公式計(jì)算樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率：

1.2.8 HPLC-DAD-MS分析 準(zhǔn)確稱取黑茶樣品適量，用色譜甲醇-水溶液超聲溶解配制成濃度為3mg/m L的樣品溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后得供試品溶液，備用。

液相色譜分析條件：Ultimate AQ C18（4.6mm×250mm i.d.，5μm，Welch），流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸（B），0～15m in，5%～20%A；15～35min，20%A；35～40m in，20%～30%A；40～45m in，30～32%A；45～50m in，32%～90%A；50～60m in，90%A。進(jìn)樣量：10μL；流速：1000μL，分流比：8∶2。DAD掃描波長(zhǎng)范圍：190～600nm。

質(zhì)譜分析參數(shù)：ESI離子源，正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)；離子化電壓：4kV；噴霧電壓4kV；鞘氣壓力：23arb；輔助氣壓力：25arb；毛細(xì)管溫度：276℃，Source CID：28。m/z掃描范圍：100～1500amu。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑茶醇提物及各萃取物的總黃酮及總酚含量

經(jīng)HPLC分析得知，氯仿萃取物中主要含有茶葉生物堿類成分（數(shù)據(jù)未給出），其他成分含量較低；因此通過(guò)氯仿萃取可脫去黑茶醇提物中大部分生物堿成分，再依次由乙酸乙酯、正丁醇萃取，可使黃酮類、酚類物質(zhì)得以富集，故乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后水層留余物的總黃酮含量及總酚含量均較黑茶醇提物高，其中乙酸乙酯萃取物的含量最高，總黃酮含量達(dá)（155.68±4.34）mg RE/g，總酚含量達(dá)（313.84±9.79）mg GAE/g；而正丁醇萃取物次之，總黃酮和總酚含量分別為（86.01±2.51）mg RE/g，（205.33± 5.94）mg GAE/g。

表1 黑茶提取物及各萃取部位的總黃酮、總酚含量Table1 Total flavonoids and total phenols contentof dark tea extracts

2.2 黑茶醇提物及各萃取物的DPPH·清除活性及還原能力

DPPH法是一種篩選自由基清除劑的簡(jiǎn)便方法，在國(guó)內(nèi)外有著廣泛的應(yīng)用[14]。從表2可知，在50μg/m L濃度下，黑茶乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物的DPPH·清除率可達(dá)70%以上，較黑茶醇提物高；EC50的結(jié)果表明，除氯仿萃取物外，各萃取物的清除活性較黑茶醇提物有所增強(qiáng)，但增強(qiáng)的程度不一，其中乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物清除活性最強(qiáng)，EC50分別為13.72μg/m L和18.89μg/m L。

鐵離子還原法（FRAP法）是利用Fe3+能與三吡啶三吖嗪（TPTZ）形成復(fù)合物，在體系中Fe3+被抗氧化劑或待測(cè)樣品還原成Fe2+，使其形成的復(fù)合物呈明顯的藍(lán)色，在593nm處具有特征吸收這一原理來(lái)評(píng)價(jià)待測(cè)樣品的抗氧化活性[15]。FRAP法不是針對(duì)某一種自由基的清除活性，而是反映樣品總的還原能力，適合實(shí)驗(yàn)室用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化活性[16]。結(jié)果（表2）顯示，除氯仿萃取物外，其他萃取物的還原能力較黑茶醇提物均有不同程度的提高，其中乙酸乙酯萃取物還原能力最強(qiáng)，F(xiàn)RAP值（50μg/m L）為1119.50μg/m L，EC1為43.38μg/m L。

綜合DPPH法及FRAP法的評(píng)價(jià)結(jié)果可知，白葉單樅黑茶的乙酸乙酯萃取物的DPPH·清除活性、還原能力最強(qiáng)，乙酸乙酯萃取有利于富集黑茶中抗氧化活性成分。

2.3 黑茶提取物及各萃取物α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制活性

表2 黑茶提取物及各萃取物的DPPH·清除活性及還原能力Table2 The results of DPPH·scavenging activity assay and FRAP assay of dark tea extract

圖1 黑茶提取物及各萃取物對(duì)α-胰淀粉酶（n=3）及α-葡萄糖苷酶（n=6）抑制活性Fig.1 α-pancreatic amylase andα-glucosidase inhibitory activity of dark tea extracts

通過(guò)抑制α-胰淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性，可抑制食物中的淀粉（多糖）分解，減少單糖的吸收，從而降低餐后血糖濃度。黑茶醇提物和各萃取物對(duì)α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶的抑制活性測(cè)定結(jié)果如圖1所示，在5mg/m L濃度下，各萃取物均顯示較黑茶醇提物更強(qiáng)的α-胰淀粉酶抑制活性，其中乙酸乙酯萃取物的抑制活性最強(qiáng)，為95.83%；在50μg/m L下，除氯仿萃取物外，其他萃取物及黑茶醇提物α-葡萄糖苷酶的抑制率均達(dá)80%以上，其中乙酸乙酯萃取物的抑制率為91.30%。

綜合抗氧化活性及體外降血糖活性評(píng)價(jià)結(jié)果可知，黑茶醇提物及各萃取物中，含有豐富黃酮類及多酚類成分的乙酸乙酯萃取物為強(qiáng)抗氧化劑同時(shí)具有最強(qiáng)的α-胰淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性。人體血液中的高血糖可通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，增加氧化應(yīng)激來(lái)破壞體內(nèi)的氧化平衡，從而損傷細(xì)胞[17]。據(jù)報(bào)道[18]，具有抗氧化活性的物質(zhì)可有助于β細(xì)胞（分泌胰島素）的再生，且能保護(hù)胰臟細(xì)胞對(duì)抗鏈脲霉素的細(xì)胞毒性。乙酸乙酯萃取物富集了黑茶中的抗氧化物質(zhì)，進(jìn)一步表明黑茶乙酸乙酯萃取物具有潛在的降血糖作用，可為黑茶的深入開發(fā)與研究提供科學(xué)依據(jù)。

2.4 黑茶乙酸乙酯萃取物化學(xué)成分的分析

圖2 黑茶乙酸乙酯萃取物的HPLC-MS-UV色譜圖Fig.2 Chromatography of HPLC-MS-UV analysis of ethyl acetate extractof dark tea

表3 黑茶乙酸乙酯萃取物的化合物保留時(shí)間、紫外吸收特征與質(zhì)譜特征Table3 Retention time and characteristics of UV absorption wavelength andmass spectrum of components in ethyl acetate extractof dark tea

根據(jù)黑茶乙酸乙酯萃取物色譜圖（圖2）中各色譜峰的紫外吸收特征，MS、MS2數(shù)據(jù)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[19]，推定出的化合物列于表3（化合物11、12、14結(jié)構(gòu)尚未確定）。經(jīng)HPLC-DAD-MS分析，推定出乙酸乙酯萃取物中的12個(gè)化合物，其中包含有3種主要的茶葉生物堿，其他的主要為以芹菜素、山奈酚為苷元的黃酮糖苷類成分，仍含有少量的黃酮苷元成分。

3 結(jié)論

白葉單樅黑茶60%醇提物經(jīng)溶劑萃取得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水層留余物，其中乙酸乙酯萃取物具有最高總黃酮含量及總酚含量，為155.68mg RE/g和313.84mg GAE/g。同時(shí)，乙酸乙酯萃取物具有強(qiáng)的抗氧化活性和體外降血糖活性，DPPH·清除活性的EC50為13.72μg/m L，F(xiàn)RAP鐵離子還原能力EC1為43.38μg/m L；5mg/m L濃度下對(duì)α-胰淀粉酶抑制率為95.83%，50μg/m L濃度下對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為91.30%。經(jīng)HPLC-DAD-MS分析，推定出乙酸乙酯萃取物中的12個(gè)化合物，其中包含有3種主要的茶葉生物堿，其他的主要為以芹菜素、山奈酚為苷元的黃酮糖苷類成分，仍含有少量的游離黃酮類成分。白葉單樅黑茶中具有強(qiáng)抗氧化活性的物質(zhì)同時(shí)也具有強(qiáng)的α-胰淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有開發(fā)成為降血糖藥物或保健食品的潛力。

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