吳小溪，米志寬

（延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安716000）

肝癌組織端粒酶活性與肝癌病理類型關(guān)系的研究

吳小溪，米志寬

（延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安716000）

目的研究肝癌組織端粒酶活性與肝癌病理類型之間的關(guān)系。方法原發(fā)性肝癌分為4種病理類型：塊狀型、結(jié)節(jié)型、小癌型和彌散型。端粒酶活性用端粒酶PCR－ELASA法檢測。結(jié)果89.4％（42／47）的肝癌標(biāo)本可測到端粒酶活性，盡管不同類型肝癌的端粒酶陽性率不同，但差異無顯著性（P＞0.05）。結(jié)論大多數(shù)肝癌標(biāo)本呈端粒酶陽性，但端粒酶陽性率與肝癌病理類型間無關(guān)聯(lián)。

端粒酶；原發(fā)性肝癌；PCR－ELASA

端粒酶（Telomerase）是真核細(xì)胞內(nèi)用于延伸端粒DNA的一種具有逆轉(zhuǎn)錄作用的核糖核蛋白酶，能以自身攜帶的RNA鏈為模板，以染色體3’末端DNA為引物延伸端粒DNA。端粒是真核細(xì)胞染色體的末端結(jié)構(gòu)，為短的重復(fù)堿基序列，具有穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)和決定細(xì)胞分裂次數(shù)等功能。正常機體除干細(xì)胞和生殖細(xì)胞外，沒有端粒酶活性，而大多數(shù)的癌細(xì)胞呈端粒酶陽性［1－3］。本研究用改良的端粒酶活性檢測方法對47例不同類型的原發(fā)性肝癌（Primary carcinoma of liver，簡稱肝癌）組織的端粒酶活性表達(dá)情況進(jìn)行了檢測與研究。

1 材料與方法

1.1 肝癌標(biāo)本

肝癌標(biāo)本分為四型。癌塊型：直徑＞5 cm，癌結(jié)節(jié)數(shù)目不等；結(jié)節(jié)型：癌結(jié)節(jié)直徑介于3～5 cm；小肝癌：孤立的直徑＜3 cm的結(jié)節(jié)或相鄰兩個結(jié)節(jié)直徑之和＜3 cm；彌散型：癌組織彌散分布無明顯結(jié)節(jié)、或者是米粒至黃豆大的結(jié)節(jié)散布全肝。做端粒酶活性檢測的肝癌組織在手術(shù)后0.5 h內(nèi)取材，置氮液中速凍后，轉(zhuǎn)入－80℃冰箱保存。

1.2 端粒酶提取與活性檢測

組織標(biāo)本各取50 mg，在200μl冰預(yù)冷的裂解液中勻漿化，置碎冰塊上30 min，4℃g離心20min，上清存－80℃?zhèn)溆?。端粒酶活性檢測用端粒酶PCR－ELISA法，簡述如下：每份樣品用25μl反應(yīng)混合液，加入細(xì)胞裂解液2μl（含30μg蛋白／ml），加去離子水50μl，用PCR儀（美國Pekin Elmer公司）進(jìn)行引物延伸與DNA擴增。陰性對照每5μl細(xì)胞提取液加1μg／μlRNA酶，37℃作用20 min，再做PCR－ELISA。PCR參數(shù)：引物延伸25℃，20 mim；端粒酶滅活94℃，5 mim；熱循環(huán)變性為94℃、30 s，復(fù)性為50℃、30 s，延伸為72℃、90 s；30個循環(huán)后，加入5μl擴增產(chǎn)物，室溫孵育10 mim后加入225μl DIG標(biāo)記探針，混勻。取上述混合液加入用親和素預(yù)包被的微量反應(yīng)板，每孔100μl。37℃下300 r／min搖床培養(yǎng)2 h。棄去雜交液，250μl洗液洗3次，每次30 s，甩凈孔內(nèi)液體，每孔加100μl抗DIG－POD，300 r／min搖床37℃培養(yǎng)30 min，甩干反應(yīng)板，加TMB液（含DIG底物）100μl，室溫顯色15 min。最后每孔加100μl終止液，用酶標(biāo)儀（DG5031型，華東電子管廠產(chǎn)品）在波長450 nm處測吸光值（A）。（樣品A值／陽性對照A值）＞2.0為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用χ2檢驗。χ2值用Pearson的檢驗公式計算，α值定為0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同類型的肝癌病理組織檢測到的端粒酶活性總陽性率為89.4％（42／47）。其中塊狀型肝癌的陽性率為88.9％（16／18），結(jié)節(jié)型肝癌的陽性率為94.1％（16／17）小癌型肝癌的陽性率為81.8％（9／11），彌散型肝癌的陽性率為100％（1／1）。經(jīng)χ2檢驗分析，不同類型肝癌組織的端粒酶陽性率之間沒有顯著性的差異（P＞0.05），見表1。

表1 肝癌組織端粒酶活性與病理類型的關(guān)聯(lián)

3 討論

1989年，Morin首先在HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了端粒酶，此后，Counter等在腹水轉(zhuǎn)移的卵巢癌中檢測到了端粒酶活性，從而引起了人們對端粒酶與惡性腫瘤關(guān)系的重視。1994年，Kim等建立了TRAP法檢測端粒酶的活性。由TRAP法又衍生出了端粒酶的PCR－ELISA檢測法，該方法具有敏感性高、特異性高和快速簡便等優(yōu)點，是迄今國際上最常用的端粒酶活性檢測方法。國內(nèi)外的研究證實，正常機體細(xì)胞除造血干細(xì)胞和生殖細(xì)胞外，一般沒有端粒酶活性，但惡性腫瘤有90％以上呈端粒酶陽性，端粒酶活性的表達(dá)是癌細(xì)胞無限增殖的必需條件。

20世紀(jì)90年代以來，肝癌已上升為我國人口惡性腫瘤死亡原因之第2位，在城市僅次于肺癌，在農(nóng)村僅次于胃癌［4］。國內(nèi)外研究表明，肝癌組織端粒酶活性陽性率在80～100之間，端粒酶活性的表達(dá)與肝癌的臨床特征和分化程度等無統(tǒng)計學(xué)上的關(guān)聯(lián)；但端粒酶檢測可作為肝癌的一種輔助診斷手段，并對肝癌預(yù)后（術(shù)后存活期）判斷有一定意義［5－8］。本研究用改良的端粒酶活性檢測方法—端粒酶PCR－ELASA法，對不同病理類型的47例肝癌組織的端粒酶活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性的陽性率為89.4％；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，未發(fā)現(xiàn)端粒酶活性的表達(dá)與肝癌病理類型之間的關(guān)聯(lián)，因此，端粒酶活性檢測可作為肝癌診斷的一個輔助項目，但不宜用于肝癌病理類型之間的區(qū)別。

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Study on the relationship between telomerase activities and pathological types of primary carcinoma of liver

WU Xiao-xi，MIZhi-kuan
（Medical College of Yan＇an University，Yan＇an 716000 China）

Objective To study the relation between telomerase activities and the pathological types of primary carcinoma of liver（PCL）.M ethods PCLs were divided into 4 pathological types：massive，nodular，small nodule，and disseminated.Telomerase activitieswere detected with PCR－ELISA method.Results telomerase activitieswere detected in 89.4％（42／47）of the PCL specimen.Although different types of PCL had different frequencies of telomerase expression，statistical analysis indicated that the difference was not significant（P＞0.05）.ConclusionAbout 90％of the PCLs is telomerase positive，however，no correlation is found between the frequency of telomerase expression and the pathological types of PCL.

telomerase；primary carcinoma of liver；PCR

R335.7；Q55

A

1672－2639（2014）01－0004－02

2013－11－20；責(zé)任編輯 趙菊梅］