韓絲銀，郭 健，紀麗麗，蔡麗雙，谷長生，宋文東，*

（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2.浙江海洋學院食品與醫(yī)藥學院，浙江舟山316022；3.浙江海洋學院石化與能源工程學院，浙江舟山316022；4.廣東海洋大學理學院，廣東湛江524088）

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）又稱合浦珍珠貝，是我國南海養(yǎng)殖珍珠的主要貝類之一，馬氏珠母貝肉是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，其粗蛋白的含量約為貝肉干重的75%[1]，此外，它還含有生理活性的游離氨基酸，其中?；撬岷孔罡哌_1.38%，占總量的74%，無機鹽含量也十分豐富，尤其是微量元素Zn和Se[2]。大量研究表明，馬氏珠母貝肉不但有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老等生理作用，還具有安神定驚、平肝潛陽、清熱解毒的功效[3-9]，因此，馬氏珠母貝肉具有很高的食用價值和藥用價值，其開發(fā)利用前景廣闊。

隨著珍珠養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，廣東、廣西、海南等主要養(yǎng)殖區(qū)采珠后馬氏珠母貝肉有4000多t，數(shù)量相當可觀。但目前主要被用于飼料加工及曬成干品出售，利用程度低下，導致經(jīng)濟附加值不高[10]，很少有對其進行深入處理后藥用和保健價值的相關報道，因此充分開發(fā)利用馬氏珠母貝肉功能價值的研究是非常必要的，本實驗考察了馬氏珠母貝肉的酶解優(yōu)化條件，并測定了其酶解產(chǎn)物對SD大鼠血清生化指標的影響，探討了其對肝功能和心血管保護的功效，旨在為資源豐富的馬氏珠母貝肉的綜合利用及開發(fā)相關功能性保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬氏珠母貝 采自廣東省湛江市徐聞縣珍珠養(yǎng)殖基地，開殼取貝肉（全臟器），清洗后-18℃冷凍備用；清潔級SD雄性大鼠 共16只，平均體重為（80±5）g，動物許可證號為：SCXK（粵）2011-015，購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心；實驗日糧 SD大鼠飼喂基礎日糧（組成及營養(yǎng)水平見表1）；木瓜蛋白酶（酶活為300萬U/g） 北京酶制劑有限公司；其他試劑 均為分析純。

電子天平 余姚銘記稱重校驗設備有限公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠制造；TG16-WS臺式高速離心機 湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；精密pH計 上海康儀儀器有限公司；電熱恒溫水熱鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；EX3600全自動生化分析儀 廣州市朗道科技開發(fā)有限公司。

表1 基礎日糧配方及營養(yǎng)水平（風干基礎，%）Table1 Composition and nutrient levels of diets（air-dry basis，%）

1.2 工藝流程

馬氏珠母貝肉→解凍→清洗→瀝干→攪碎→保溫酶解→滅酶→離心→上清液→水解度測定。

取瀝干的馬氏珠母貝肉用搗碎機打漿，用蒸餾水制成5%的勻漿，然后加入木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH，在特定溫度下酶解一定時間。滅酶，離心，取上清液測定水解度。

1.3 馬氏珠母貝肉酶解的條件優(yōu)化

1.3.1 單因素實驗設計

1.3.1.1 木瓜蛋白酶用量實驗 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，木瓜蛋白酶在pH 7.0，溫度為60℃條件下水浴30m in，考察酶用量（木瓜蛋白酶用量與馬氏珠母貝肉原料質(zhì)量比）分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%對水解度的影響。

1.3.1.2 酶解溫度實驗 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在pH 7.0，酶用量0.6%條件下，溫度分別為55、 60、65、70、75、80℃水浴30m in，對馬氏珠母貝肉進行酶解。

1.3.1.3 酶解時間實驗 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在pH 7.0，酶用量為0.6%，溫度70℃條件下，分別水浴10、15、20、25、30、35m in，對馬氏珠母貝肉進行酶解。

1.3.1.4 酶解pH實驗 稱取20g的馬氏珠母貝肉6份，在酶用量0.6%，溫度70℃條件下，pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0水浴30m in，對馬氏珠母貝肉進行酶解。

1.3.2 正交實驗設計 以馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度為考察指標，首先通過單因素實驗考察木瓜蛋白酶用量、溫度、pH和時間對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響，初步確定馬氏珠母貝肉酶解條件的范圍，然后在單因素實驗的基礎上，采用L9（34）正交表對酶解條件進行進一步優(yōu)化，其因素水平安排見表2。

表2 馬氏珠母貝肉酶解正交實驗因素水平表Table2 Factors and their coded levels used in orthogonal array design

1.4 指標測定

1.4.1 總氮含量的測定 馬氏珠母貝中總氮含量采用凱氏定氮法測定[11]。

1.4.2 游離氨基氮的測定 游離氨基氮含量采用茚三酮法測定[12]。

1.4.3 水解度的計算 計算公式如下：

馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度DH（%）=水解液中游離基氮含量（mg/m L）/樣品中的總氮含量（mg/m L）×100。

1.5 注射液配制

在配制容器中，依次加入注射用水800m L，生理鹽水80m L，馬氏珠母貝肉酶解上清液100m L，混勻，用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0左右，再加入注射用水定量至1000m L，混勻，過濾兩次（先砂濾棒過濾一次，再用孔徑為0.65μm微孔濾膜過濾一次），分裝于中性玻璃容器中，高壓滅菌30m in，在0～4℃溫度條件保存。

1.6 注射管理

SD大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，實驗組8只，對照組8只，自由采食、飲水。一周后，在喂食2h后，實驗組的SD大鼠腹腔（0.1m L/10g）注射所配制的注射液，對照組腹腔注入等量生理鹽水。連續(xù)注射2d，1d兩次。

1.7 樣品采集與測定

注射實驗結(jié)束后，禁食24h，然后將所有大鼠麻醉后切開腹部，于腹股動脈抽取血液，3500r/m in離心10min，分離血清，保存于-20℃，采用全自動生化分析儀測定其生化指標。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003對數(shù)據(jù)處理，Origin 9.0繪圖分析，并采用SPSS 17.0進行配對樣本t檢驗，其結(jié)果以平均值±標準偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珠母貝肉酶解的單因素實驗

2.1.1 木瓜蛋白酶用量對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖1可以看出，隨著酶用量增加，酶解液的水解度呈增加趨勢，且在酶用量為0.6%的時候水解度已經(jīng)接近最大值，若此時增加酶用量，水解度的值也不會顯著增加。這是因為當?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶的濃度超過一定范圍，它的催化速率也不會再上升，而是維持在一個平衡的狀態(tài)。故選擇酶用量為0.6%時最佳。

圖1 酶用量對水解度的影響Fig.1 Effect of dosage of enzyme on degree of hydrolysic

2.1.2 溫度對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖2可以看出，反應溫度低于70℃時，隨著溫度的升高，水解度逐漸上升，當溫度大于70℃時，隨著溫度的持續(xù)升高，水解度迅速下降。由酶促反應原理可知，當酶在一定溫度范圍，隨著反應溫度升高而加快反應速度，但溫度超過某一界限后，蛋白質(zhì)會變性，變性的速度遠遠大于反應的速度。因此，酶解溫度在70℃時，馬氏珠母貝肉酶解效果最好。

圖2 溫度對水解度的影響Fig.2 Effectof temperature on degree of hydrolysic

2.1.3 時間對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖3可以看出，隨著時間的延長，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度先迅速增大，后趨于穩(wěn)定，當水解超過30min，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度變化不大，原因可能是在30m in時木瓜蛋白酶對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)的水解已經(jīng)達到了平衡狀態(tài)，隨著時間的延長也不會發(fā)生變化，故水解時間為30～35m in區(qū)間內(nèi)時，馬氏珠母貝肉酶解效果最好。

圖3 時間對水解度的影響Fig.3 Effect of time on degree of hydrolysic

2.1.4 pH對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度的影響 從圖4可以看出，當pH＜8.0的時候，隨著pH的增大，水解度都呈顯著增大趨勢，在pH 8.0時達到最大值，當pH＞8.0時，隨著pH升高，水解度逐漸下降；這是因為大部分酶的活力受其環(huán)境pH的影響，由于環(huán)境體系中酸、堿度的改變，酶的空間結(jié)構(gòu)受到影響，極端情況可以致使酶失活；即酶在一定pH條件下，酶反應具有最大速度，此時酶活力相對最高，高于或者低于此值，反應速度下降。因此選擇pH8.0作為木瓜蛋白酶酶解馬氏珠母貝肉的最適pH。

圖4 pH對水解度的影響Fig.4 Effectof pH on degree of hydrolysic

2.2 酶解馬氏珠母貝肉的正交實驗

從表3、表4分析可知，對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度值影響的大小次序為B（溫度）＞D（pH）＞A（酶用量）＞C（時間），即溫度對馬氏珠母貝肉酶解效果影響最大，pH對酶解效果影響次之，酶用量對酶解效果影響較小，時間對酶解效果影響最小。通過各因素綜合分析，馬氏珠母貝肉酶解最優(yōu)條件為A2B2C3D2，即酶用量0.6%，溫度70℃，時間35m in，pH 8.0，在此條件下，馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度為54.79%。

2.3 馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物對SD大鼠的血清指標的影響

由表5可以看出，馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物處理組使SD大鼠血清中前白蛋白、載脂蛋白A1分別上升了38.07%（p＜0.05）、276%（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反應蛋白、葡萄糖、間接膽紅素分別下降了44.57%（p＜0.05）、40.4%（p＜0.05）、46.67%（p＜0.05）、42.13%（p＜0.05）、100%（p＜0.05）、36.97%（p＜0.05）、49.49%（p＜0.05）。

表3 馬氏珠母貝肉酶解正交實驗設計及結(jié)果Table3 Orthogonal array design scheme and corresponding results

表4 方差分析表Table4 Analysis of variance

表5 實驗組與對照組SD大鼠血清生化指標的比較Table5 The comparison between experimental group and control group of serum biochemical indicators in animal SD rat

給SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物，使其血清中的前白蛋白較對照組顯著升高（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、超敏C反應蛋白、間接膽紅素較對照組顯著下降（p＜0.05），而在肝病診斷中，血清前白蛋白（PA）是一項反映肝功能受損情況的早期敏感的指標[13]，肝功能損害程度越嚴重，血清PA越低[14]。超敏C-反應蛋白（CRP）是一種正時相反應蛋白，它和PA是相對應的[15]，在肝組織受到損傷時，因存在一定的炎癥應急激反應，CRP就會增高[16]。轉(zhuǎn)氨酶升高也是反映肝臟損傷的標志之一，在臨床上較常見，而在谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷酰轉(zhuǎn)肽酶等肝酶中，ALT與肝臟脂肪聚集關系最為密切[17]。膽紅素代謝主要在肝臟進行，新生兒時期膽紅素產(chǎn)生過多，會使肝細胞負荷加重、膽紅素對肝細胞的直接毒性作用、炎癥反應破壞肝細胞[18]而使肝酶異常。因此本研究結(jié)果表明馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物能夠促進肝功能逐漸恢復正常。

給SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物，使其血清中的載脂蛋白A1較對照組顯著升高（p＜0.05），超敏C-反應蛋白、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、葡萄糖較對照組顯著下降（p＜0.05），而Ridker等[19]研究認為，高水平的CRP使急性心肌梗死的風險增加3倍，是較敏感的心血管預測因子。國內(nèi)絕大多數(shù)臨床資料顯示，心肌梗死和腦卒中患者與對照組比較載脂蛋白A1明顯降低，載脂蛋白B顯著增高?？偨Y(jié)國外人群前瞻性研究結(jié)果顯示，載脂蛋白A1、B在預測ACVD和冠狀動脈事件的危險性優(yōu)于LDLC、TC、TG和HDLC等[20-25]。肌酸激酶同工酶（CK-MB）在心血管疾病中，是診斷心肌梗死的敏感指標[26-27]。急性心肌梗死（AMI）時心肌細胞受損，膜的完整性和通透性改變，使細胞內(nèi)的大分子逸出，其中CK-MB是逸出最早，上升幅度最大的一種酶[28]，并且肝炎合并心肌損害時也易引起CK-MB相對值升高，嚴重肝損害或高黃疽時都可能出現(xiàn)CK-MB絕對值升高。而糖尿病是世界公認的冠心病的獨立危險因素之一[29]，AM I后血糖升高會導致患者的心機損害加重，病死率明顯高于血糖正常組[30]。所以積極有效地控制AM I患者的血糖水平，預防糖尿病的發(fā)生，對早期預防和控制并發(fā)癥，降低患者的病死率有積極作用。因此本研究結(jié)果表明馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物能夠減少心肌損害，縮小梗死面積，降低心律失常、心力衰竭、心源性休克及死亡病例的發(fā)生。

3 結(jié)論

本文在單因素實驗的基礎上通過正交實驗設計優(yōu)化馬氏珠母貝肉酶解的工藝條件，結(jié)果表明，各因素對馬氏珠母貝肉蛋白質(zhì)水解度影響大小次序是溫度＞pH＞酶用量＞時間，同時確定了馬氏珠母貝肉酶解的最適工藝條件，即酶用量0.6%，溫度70℃，時間35m in，pH8.0。對SD大鼠注射馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物的調(diào)配試劑，使血清中前白蛋白、載脂蛋白A1顯著上升（p＜0.05），谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、載脂蛋白B、肌酸激酶MB型同工酶、超敏C反應蛋白、葡萄糖、間接膽紅素較對照組顯著下降顯著下降（p＜0.05），結(jié)合相關研究，推測出馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物有保肝、保心血管的功效。因此馬氏珠母貝肉酶解液是值得開發(fā)的功能性物質(zhì)。

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