李穎暢，王亞麗，劉明爽，馬春穎，張麗華，勵建榮

（1.渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013；2.遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013；3.遼寧省高校重大科技平臺“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013）

活性氧自由基，例如羥自由基、超氧陰離子影響細(xì)胞膜的流動性，使蛋白質(zhì)多肽鏈發(fā)生斷裂，脂質(zhì)過氧化、DNA氧化，從而會引起一些慢性疾病，例如癌癥、炎癥、高血脂和動脈硬化等[1]。多酚具有抗氧化、降血脂、降血糖、防止心血管疾病作用，對這些疾病的預(yù)防與治療很多是源于多酚的抗氧化活性[2-4]。近年來，由于多酚廣泛的生物活性，引起了人們的熱切關(guān)注。紫菜是紅藻門（Rhodophyta）原紅藻綱（Protoflorideophy-ceae）紅毛菜目（Bangiales）紅毛菜科（Bangiaceae）紫菜屬（Porphyra）的統(tǒng)稱[5]。在我國紫菜是食用較普遍的海藻之一，具有豐富的營養(yǎng)，是理想的高蛋白低脂肪的健康食品。研究表明，紫菜的蛋白質(zhì)含量為20%～35%，與大豆蛋白含量相似。紫菜富含有8種人體必需的氨基酸，并且不飽和脂肪酸的含量較高，可以有效預(yù)防心血管疾病[6-8]。紫菜中維生素的含量也比較豐富，主要含有B族維生素、維生素C、維生素E、胡蘿卜素等[9]。同時，紫菜由于生長在化學(xué)組分極為復(fù)雜的海水中，還蘊含極為豐富的無機成分，是重要的礦物質(zhì)來源[10]，同時紫菜中多糖、多酚含量也非常豐富[8]。鐘明杰和王陽光[11]采用微波技術(shù)對紫菜多酚進(jìn)行了提取并研究對DPPH自由基的清除能力和還原力。趙國玲等[12]研究了壇紫菜不同溶劑組分的抗氧化活性。關(guān)于一些理化因素對紫菜多酚提取物抗氧化活性的影響還未見報道，同時羥基自由基是對人體健康危害最大的自由基[13]，本文研究了溫度、光照、微波pH對紫菜多酚提取物清除羥基自由基的影響，這對紫菜多酚充分應(yīng)用于食品的加工與貯藏中具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫菜 大連遼海食品貿(mào)易有限公司；水楊酸、硫酸亞鐵、無水乙醇、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、檸檬酸、檸檬酸鈉 分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸、鄰苯三酚（焦性沒食子酸） 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AB-8大孔樹脂 天津海光化工有限公司。

RRH-100型萬能高速粉碎機 歐凱萊芙（香港）實業(yè)公司；FA2410型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計日本島津；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環(huán)水真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；pHS-25型酸度計 上海理達(dá)儀器廠；柱層析裝置 上海青浦滬西儀器廠；DHG-9038型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；真空冷凍干燥機 THERMO；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫菜多酚提取物的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[14]，略作修改。將紫菜50℃烘干，粉碎后過40目篩。稱取20g紫菜粉末，按1∶30（g/m L）的料液比加入59%的乙醇溶液，超聲波輔助提取紫菜多酚，超聲功率468W，超聲時間13m in，提取后過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃濃縮，AB-8大孔樹脂純化，濃縮洗脫液，冷凍干燥機干燥，得到淺紅色粉末。

1.2.2 Folin-Ciocalteu法[15]測定多酚含量 精確稱取25mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容到1000m L，配制成25μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確量取1m L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液和1m L樣品溶液于25m L容量瓶中，加入1m L Folin-Ciocalteu試劑，0.5～8min內(nèi)加入3m L 10%Na2CO3溶液，混勻后定容，在30℃下避光放置1.5h，在330～ 1100nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定最佳吸收波長。精確吸取0、1、2、3、4、5、6m L上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于25m L容量瓶中，按照上述操作進(jìn)行實驗，在最佳波長下測定吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過波長掃描確定最大吸收波長為750nm，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.1039x+0.008，R2=0.9990，吸光度與濃度具有良好的線性關(guān)系。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算紫菜多酚含量，紫菜多酚提取物中多酚含量為73.17%，后續(xù)實驗紫菜多酚濃度是以實際多酚含量進(jìn)行計算的。

1.2.3 清除羥基自由基（·OH）能力的測定[16]利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm波長處有最大吸收。在反應(yīng)體系中加入1m L 10mmol/L的FeSO4溶液，1m L 10mmol/L水楊酸溶液（溶劑為乙醇）后，分別量取不同濃度紫菜多酚提取物各1m L，最后加入1m L 8.8mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)30m in，在510nm波長處測定各濃度的吸光度。

式中：A0為用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液代替樣品的吸光度；Ai為加入樣品溶液的吸光度；Aj為不加顯色劑H2O2樣品溶液的吸光度。

1.2.4 紫菜多酚濃度的選擇 將紫菜多酚配制成濃度為100、200、300、400、500、600μg/m L的溶液，并按上述方法測定其對羥基自由基清除能力，然后按清除率公式分別計算其對羥自由基的清除率，當(dāng)清除率達(dá)到一定值后并開始處于穩(wěn)定狀態(tài)，此時紫菜多酚濃度為最適宜的濃度。

1.2.5 不同處理方式對紫菜多酚清除羥基自由基的影響

1.2.5.1 溫度對紫菜多酚清除羥基自由基的影響 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于錐形瓶中，蓋緊塞子，分別用30、60、90℃水浴中加熱5h，每隔1.0h取出錐形瓶，立即用自來水冷卻，測定紫菜多酚對羥基自由基的清除率。

1.2.5.2 光照對紫菜多酚清除羥基自由基的影響 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于錐形瓶中，蓋緊塞子，分別置于自然光光照和避光，每隔一段時間（0、2、5、10、15、25d）取樣測定對羥基自由基清除率。

1.2.5.3 微波對紫菜多酚清除羥自由基的影響 量取500μg/m L紫菜多酚溶液100m L于錐形瓶中，蓋緊塞子，用微波處理，微波功率為600W，測定不同微波處理時間（0、2、5、10、15、20、25、30m in）對羥基自由基清除率。

1.2.5.4 pH對紫菜多酚清除羥自由基的影響 將紫菜多酚濃縮液用不同pH的緩沖溶液稀釋，測定在不同pH條件下（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）對羥基自由基的清除率。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，p＜0.05為差異顯著，實驗數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菜多酚濃度對清除羥基自由基的影響

從圖1可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著紫菜多酚濃度的增加，多酚對羥自由基清除率提高。紫菜多酚濃度超過500μg/m L后，清除率增長緩慢，當(dāng)紫菜多酚濃度為500μg/m L與600μg/m L時，清除率無顯著性差異（p＞0.05）。因此，選擇500μg/m L的紫菜多酚溶液作為以下實驗的最適宜溶液。

圖1 紫菜多酚濃度對清除羥自由基的影響Fig.1 The effectof concentration of polypenols from Porphyra dentate on scavenging hydroxyl free radical

2.2 溫度對紫菜多酚清除羥基自由基的影響

從圖2可以看出，不同溫度對紫菜多酚提取物清除羥自由基能力的影響不同。在30℃時，隨著時間的延長，紫菜多酚對羥自由基的清除率無顯著變化。60℃時，在最初1h，對羥基自由基的清除率顯著降低（p＜0.05），以后清除率變化趨于平緩。90℃對紫菜多酚清除羥自由基有顯著影響，隨時間的延長，清除率呈下降趨勢?？赡苁歉邷貙?dǎo)致紫菜多酚部分降解，紫菜多酚對羥基自由基的清除能力下降。Kaiser等[17]研究發(fā)現(xiàn)熱處理使部分多酚含量降低，影響多酚穩(wěn)定性，這和我們研究結(jié)果是一致的?？梢娫?0℃以內(nèi)，紫菜多酚保存比較好，紫菜多酚對羥基自由基清除能力相對較高。

圖2 溫度對紫菜多酚清除羥自由基的影響Fig.2 The effectof temperature on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.3 光照對紫菜多酚清除羥基自由基的影響

從圖3可以看出，光照影響紫菜多酚對羥基自由基的清除率。在避光條件下，紫菜多酚對羥基自由基的清除率隨著時間的延長而降低；10d之內(nèi)，對羥基自由基清除率降低緩慢，10d之后對羥基自由基清除率降低加速。相對避光條件，自然光光照條件下紫菜多酚對羥自由基清除率降低幅度比較大。放置25d后，自然光光照和避光條件下，紫菜多酚對羥基自由基的清除率分別為39.73%和50.64%。說明紫菜多酚在避光條件下相對比較穩(wěn)定，清除羥自由基能力比較強。

圖3 光照對紫菜多酚清除羥自由基的影響Fig.3 The effectof lighton scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.4 微波對紫菜多酚清除羥自由基的影響

從圖4可以看出，在微波處理5m in之內(nèi)，紫菜多酚對羥基自由基清除率降低比較少，在10min時，清除率快速降低，之后清除率降低趨于平緩。可能的原因是，微波使一些多酚聚合體降解，多酚清除率提高；同時存在微波對多酚的熱效應(yīng)，使多酚清除率降低，紫菜多酚對羥基自由基清除率的影響是二者綜合作用的結(jié)果。

圖4 微波對紫菜多酚清除羥自由基的影響Fig.4 The effectofmicrowave on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

2.5 pH對紫菜多酚清除羥自由基的影響

從圖5可以看出，pH 3.0～6.0時，紫菜多酚對羥基自由基清除率沒有明顯變化，pH7.0時，清除率略有降低，但下降不顯著，說明紫菜多酚在pH 3.0～7.0比較穩(wěn)定，對羥基自由基清除能力較高。在pH8.0時，紫菜多酚對羥基自由基清除率顯著下降?？梢娮喜硕喾釉谒嵝詶l件下抗氧化活性比較穩(wěn)定，在堿性條件下抗氧化活性不穩(wěn)定。

3 結(jié)論

紫菜多酚對羥基自由基有較強的清除效果，且隨紫菜多酚濃度的增加，清除作用增強。加熱使紫菜多酚清除羥基自由基能力降低，在60℃以內(nèi)，紫菜多酚保存比較好，紫菜多酚對羥基自由基清除能力相對較高；溫度超過60℃后，隨加熱時間延長、加熱溫度升高，對氧自由基清除能力降低的越多。光照方式對清除羥自由基能力降低幅度為自然光光照＞避光，光照時間越長，清除率降低幅度越大。微波影響紫菜多酚對羥基自由基清除率，在10min時，清除率快速降低，之后清除率降低趨于平緩。在pH 3.0～7.0紫菜多酚對羥基自由基清除能力比較穩(wěn)定。

圖5 pH對紫菜多酚清除羥自由基的影響Fig.5 The effect of pH on scavenging hydroxyl free radical of polypenols from Porphyra dentate

[1]Williams G M，Jeffrey A M.Oxidative DNA damage：Endogenous and chemically induced[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2000，32（3）：283-292.

[2]Boulekbache-Makhlouf L，SlimaniS，MadaniK.Total phenolic content，antioxidant and antibacterial activities of fruits of Eucalyptus globulus cultivated in Algeria[J].Industrial Crops and Products，2013，41：85-89.

[3]Verma PR，Deshpande SA，Kamtham YN，etal.Hypolipidemic and antihyperlipidemic effects from an aqueous extract of Pachyptera hymenaea（DC.）leaves in rats[J].Food Chemistry，2012，132（3）：1251-1257.

[4]Nwosu F，Morris J，Lund V A，et al.Anti-proliferative and potential anti-diabetic effects of phenolic-rich extracts fromediblemarine algae[J].Food Chemistry，2011，126（3）：1006-1012.

[5]姜橋，周德慶，孟憲軍，等.我國食用海藻加工利用的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2005，26（9）：186-188.

[6]王海洪，王揚，徐大倫.紫菜加工利用可行性分析[J].食品科技，2006（6）：29-30.

[7]Jung W K，Choi I，Oh S，et al.Anti-asthmatic effect of marine red alga（Laurencia undulata）polyphenolic extracts in a murinemodelof asthma[J].Food and Chemical Toxicology，2008，47（2）：293-297.

[8]呂鐘鐘，羅建光，管華詩.紫菜的生物活性研究進(jìn)展[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報，2009，39：47-51.

[9]Watanabe F，Takenaka S，Katsura H，et al.Characterization of a vitamin B12compound in the edible purple laver，Porphyra yezoensis[J].BiosciBiotechnolBiochem，2000，64（12）：2712-2715.

[10]Shaw N S，Liu Y H.Bioavailability of iron from purple laver（Porphyra spp.）estimated in a rat hemoglobin regeneration bioassay[J].JAgr Food Chem，2000，48（5）：1734-1737.

[11]鐘明杰，王陽光.微波輔助提取紫菜多酚及抗氧化活性研究[J].食品科技，2010，35（10）：204-207.

[12]趙國玲，劉承初，謝晶，等.壇紫菜不同溶劑組分的抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：186-191.

[13]Royer M，Diouf PN，Stevanovic T.Polyphenol contents and radical scavenging capacities of red maple（Acer rubrum L.）extracts[J].Food and ChemicalToxicology，2011，49（9）：2180-2188.

[14]涂宗才，張露，王輝，等.超聲波輔助提取黎蒿多酚工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（2）：239-242.

[15]Singleton V L，Orthofer R，Lamuela-Raventos RM.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants bymeans of Folin-Ciocalteu reagent[J].Methods in Enzymology，1999，299：152-178.

[16]李穎暢，孟憲軍.藍(lán)莓花色苷抗氧化活性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（9）：61-64.

[17]Kaiser A，Hartmann K I，Kammerer DR，etal.Evaluation of the effects of thermal treatments on color，polyphenol stability，enzyme activities and antioxidant capacities of innovative pasty celeriac（Apium graveolens L.var.rapaceum（Mill.）DC.）products [J].Eur Food Res Technol，2013，237（3）：353-365.