魏晉梅，羅玉柱，*，白云旭

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)研究測(cè)試中心，甘肅蘭州730070；2.甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070）

鎮(zhèn)靜劑（sedative）是指能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生輕度抑制，減弱機(jī)能活動(dòng)，從而起到消除躁動(dòng)不安、恢復(fù)安靜的一類(lèi)藥物。近年來(lái)，個(gè)別畜牧業(yè)飼養(yǎng)者因經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，擅自在畜禽飼養(yǎng)過(guò)程中添加此類(lèi)藥物以起到鎮(zhèn)靜催眠、增重催肥、縮短出欄時(shí)間的作用；另外，在動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中，為減少動(dòng)物死亡和體重下降，防止肉品質(zhì)降低，也常使用此類(lèi)藥物以減少應(yīng)激帶來(lái)的損失[1]。非法使用此類(lèi)藥物會(huì)使其原形和代謝產(chǎn)物不可避免地殘留于動(dòng)物源食品中，人們食用了這些食品后，肝臟負(fù)擔(dān)加重，頭腦長(zhǎng)期昏沉，記憶受影響，同時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和肌肉功能受到抑制，因此許多國(guó)家都將此類(lèi)藥物列為禁用藥物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告規(guī)定嚴(yán)禁在動(dòng)物飼料和飲用水中使用此類(lèi)藥物，在動(dòng)物源食品中不得檢出此類(lèi)藥物[2]。

目前，檢測(cè)鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS-MS）[3-9]、液相色譜法（HPLC）[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[12-13]等。國(guó)標(biāo)規(guī)定檢測(cè)此類(lèi)藥物用液-質(zhì)聯(lián)用法[14-15]，但這種方法投資大、成本高，很多實(shí)驗(yàn)室條件不具備。本文建立了羊肉中11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留量的液相色譜檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)成本低、靈敏度高、回收率高，能滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肉樣品 購(gòu)自桃海市場(chǎng)（蘭州）；對(duì)照品：唑吡坦（171258-200601）、氟哌啶醇（100313-200301）、氯氮卓（171248-200301）、氯丙嗪（100460-200501）、奮乃靜（100133-200602）、氟奮乃靜（100162-201003）、奧沙西泮（171229-201104）等 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲苯噻嗪（11010，純度≥98.0%）、丙酰丙嗪（10404，純度≥99.0%）、咔唑心安（00421，純度≥99.0%）等 Dr.Ehrenstorfer公司標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)）；氟哌利多（CDCU-1229001） USP標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇 為色譜純?cè)噭?，?gòu)自DIKMA公司（美國(guó)）；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

Agilent1100 series液相色譜儀 配有二元泵、DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；AB104-N電子天平 Mettler Toledo公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州市亞榮儀器有限公司；SUPRA 22K高速離心機(jī) 韓國(guó)Hanil公司；KH3200B型超聲波清洗器 功率150W，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 取新鮮羊肉背最長(zhǎng)肌100g，切碎后混合、均質(zhì)，于-18℃冷凍保存、備用。

提?。喝【|(zhì)樣品5.0g于50m L具塞離心管內(nèi)，加入15m L 1%氨水-乙腈溶液，超聲提取10m in，4000r/m in離心5m in，移出上清液，重復(fù)上述步驟2次，合并上清液。向上清液中加入5.0g NaCl，充分混合，靜置5m in，移除上清液，于35℃減壓濃縮至近干，加入1m L甲醇溶液，渦旋至瓶?jī)?nèi)殘?jiān)咳芙庀聛?lái)，過(guò)0.22μm有機(jī)相濾膜后，進(jìn)HPLC分析測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%甲酸（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～8min，90%B→55%B；8～13min，55%B→5%B；13～25min，5%B→90%B）；流速0.8m L/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)245nm、254nm；自動(dòng)進(jìn)樣器樣品室溫度25℃，進(jìn)樣量10μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取唑吡坦、氟哌啶醇、氯氮卓、氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜、奧沙西泮、甲苯噻嗪、丙酰丙嗪、咔唑心安、氟哌利多等11種標(biāo)準(zhǔn)品10.00mg，用甲醇溶解，并定容至50m L的棕色容量瓶中，制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。此儲(chǔ)備液中11種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為200μg/m L。使用前用甲醇將此儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液和標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)嘗試了分別用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、0.1%氨水-乙腈、甲醇-乙酸乙酯（v/v，1∶1）等試劑對(duì)樣品進(jìn)行提取。甲醇、乙酸乙酯和甲醇-乙酸乙酯提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時(shí)呈非常渾濁、粘稠狀，用甲醇洗脫，經(jīng)C18小柱凈化后，溶液澄清，但放置過(guò)夜后溶液中有絮狀物；乙腈和0.1%氨水-乙腈提取液較澄清，但乙腈提取液的回收率低。原因可能是氯氮卓、奧沙西泮屬于苯二氮卓類(lèi)藥物，唑吡旦是咪唑并吡啶類(lèi)藥物，氯丙嗪是吩噻嗪類(lèi)藥物。苯二氮卓類(lèi)藥物具有類(lèi)似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且大多數(shù)呈中性或弱堿性，因此在弱的酸性或堿性條件下即可被有機(jī)溶劑提取出來(lái)。吩噻嗪類(lèi)藥物屬于脂溶性藥物，在堿性條件下易溶于有機(jī)溶劑。因此，本實(shí)驗(yàn)選用0.1%氨水-乙腈作為提取溶劑。另外，實(shí)驗(yàn)中用了HLB和C18小柱兩種固相萃取柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化，結(jié)果表明兩種小柱的凈化效果沒(méi)有明顯差異。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別用甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，有些藥物同時(shí)出峰或出雙肩峰，分離效果不好。甲醇-0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，11種藥物都能很好地分離，便于定性、定量。在190～380nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描后發(fā)現(xiàn)，254nm時(shí)各藥物都有很好的響應(yīng)，但甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌利多、氯氮卓、丙酰丙嗪、氟哌啶醇、奧沙西泮等8種藥物在245nm的響應(yīng)值更高，因此，選擇254nm作為氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜3種藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)，其他8種藥物的檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm（圖1）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次進(jìn)HPLC分析，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得到11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（表1）。以信噪比（S/N）等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物的檢出限（表1）。甲苯噻嗪、唑吡坦、咔唑心安、氟哌啶醇、氯氮卓、丙酰丙嗪、氯丙嗪、奮乃靜、氟奮乃靜在0.02～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系，奧沙西泮在0.005～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系，氟哌利多在0.05～200μg/m L范圍有良好的線性關(guān)系。

表1 11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物的線性回歸方程及檢出限Table1 Linear functions and detection limit of 11 sedatives

2.4 方法的回收率與精密度

在空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.2.1方法制備樣品，平行測(cè)定六次，將測(cè)得的峰面積代入回歸方程，計(jì)算各鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物的含量，并計(jì)算出平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。11種藥物的平均回收率在64.0%～121.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。

圖1 11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物在選定色譜條件下的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 11 sedatives by HPLC

表2 方法的回收率和精密度Table2 Spiked recoveries and precision of 11 sedatives in blank samples

3 結(jié)論

本文建立了羊肉中11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物的HPLC測(cè)定方法，以甲醇-0.1%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用245nm和254nm兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，11種藥物得到了很好的分離和較強(qiáng)的吸收。該方法回收率高、精密度好，能夠滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需求。

[1]張力群，吳平谷，金銓?zhuān)?鎮(zhèn)靜劑殘留分析的色譜檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（6）：1634-1638.

[2]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193號(hào)，食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單[G].2002.

[3]孫雷，張?bào)P，徐倩，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肉和豬腎種殘留的10種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物[J].色譜，2010，28（1）：38-42.

[4]祝波，趙宗閣，王尊文，等.LC-MS/MS法分析保健品及中成藥中添加的15種鎮(zhèn)靜催眠劑[J].藥物分析雜志，2010，30（4）：745-751.

[5]錢(qián)曉東，于慧娟，惠蕓華，等.水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（19）：134-137.

[6]嚴(yán)麗娟，張潔，潘晨松，等.超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法高通量篩查乳制品中20種鎮(zhèn)靜劑[J].分析化學(xué)，2013，41（1）：31-35.

[7]吳寧鵬，班付國(guó)，彭麗，等.超高效液相色譜一串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法篩查飼料中11種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2012，33（2）：94-99.

[8]李存，皇甫偉國(guó)，楊挺，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定豬尿中10種鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘留量[J].分析化學(xué)，2010，38（7）：1015-1018.

[9]Sooyeun Lee，Eunyoung Han，Sanghwan In，etal.Determination of illegally bused sedative-hypnotics in hair samples from drug offenders[J].Journal of Analytical Toxicology，2011（35）：312-315.

[10]梁湘輝，戴智勇，劉文恩.反向高效液相色譜測(cè)定法同時(shí)測(cè)定人血漿中5種鎮(zhèn)靜催眠藥濃度[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，34（7）：689-693.

[11]董小海，胡京枝，趙光華.動(dòng)物組織中氯丙嗪殘留的檢測(cè)-HPLC法[J].農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，2009（1）：32-33.

[12]汪麗萍，李翔，孫英，等.氣相色譜/質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中4種苯二氮類(lèi)鎮(zhèn)靜劑殘留[J].分析化學(xué)，2005，33（7）：951-954.

[13]Linli Cheng，Yujie Zhang，Jianzhong Shen，et al.GC-MS method for simultaneous determination of four sedative hypnotic residues in swine tissues[J].Chromatographia，2010（71）：155-158.

[14]SN/T 2113-2008進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類(lèi)藥物殘量的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[G].中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).

[15]GB/T 22993-2008牛奶和奶粉中八中鎮(zhèn)定劑殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[G].中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).