游玉明，陳澤雄，張美霞，冉 烈

（重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶402160）

金銀花（Lonicera japonica）又名忍冬花、銀花、雙花等，為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾，主要分布于我國山東、河南、陜西等省[1]。金銀花中含有多酚類、皂苷、揮發(fā)油和環(huán)烯醚萜類等多種生物活性成分[2-3]，因而具有廣譜抑菌、抗病毒、消炎、保肝利膽及增強免疫等功效[4-7]，是我國衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物材料之一，具有較高的食用及藥用價值[8]。多酚類化合物是高等植物中普遍存在的次級代謝產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性，是金銀花的主要有效成分[9-11]。目前，分析金銀花多酚類化合物的方法主要有分光光度法[12]、高效液相色譜法[13-14]、毛細管電泳法[15-16]及高效液相色譜-質(zhì)譜法[17-18]等。分光光度法只能測定總酚含量，不能測定單體酚類物質(zhì)的含量。高效液相色譜-質(zhì)譜法多為定性篩查，且方法使用的儀器設備成本高，不易普及。高效液相色譜法具有高效、靈敏度和檢出率高、且易于推廣等優(yōu)點，是目前使用最廣泛的方法，但近年來所報道的文獻中均只檢測了金銀花中綠原酸和木犀草苷等藥典中規(guī)定的指標性成分或者少數(shù)幾種黃酮類化合物[19-21]，而對于金銀花中綠原酸、木犀草苷、蘆丁、咖啡酸等7種多酚類化合物的同時分離測定，還未見報道。因此，本研究采用HPLC-DAD法建立了一種可同時測定金銀花中7種多酚類物質(zhì)的檢測方法，并在此基礎上，選擇幼蕾、三青、二白等金銀花7個典型性花期，研究不同花期對金銀花中多酚含量的影響，以期為金銀花的品質(zhì)控制、藥理作用機理及其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 選自重慶市秀山縣金銀花主栽品種“渝蕾一號”，根據(jù)花期共采集幼蕾、三青、二白、大白、銀花、金花、凋花共7個花期的樣品。采摘后立即采用真空冷凍干燥機干燥后保存于陰涼干燥處；綠原酸（Chlorogenic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、香豆酸（p-Coumalic acid）、肉桂酸（trans-Cinnam ic acid）、木犀草苷（Luteolin-7-O-glucoside）、蘆?。≧utin），純度95%以上 美國Sigma公司；甲醇、乙腈為色譜純 成都市科龍化工試劑廠；乙醇、甲酸為分析純 重慶川東化工有限公司。

LC-20A型高效液相色譜儀（配有LC-20AT泵、SIL-20A型自動進樣器、CBM-20A系統(tǒng)控制器、SPDM 20A型二級管陣列檢測器、CTO-20A型柱溫箱）日本島津公司；ALPHA 1-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；3-18K型離心機 德國SIGMA公司；SB-5200D型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FW 100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 分別稱取綠原酸、阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸及蘆丁標準品50～65mg，木犀草苷5.8mg，用體積分數(shù)70%的甲醇定容至10m L，配制成標準儲備液置于-20℃冰箱中保存。待用時分別準確吸取不同體積綠原酸、阿魏酸、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸、蘆丁及木犀草苷的標準儲備液，將其中除木犀草苷外的6種標準儲備液用70%甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5～500mg/L，木犀草苷的質(zhì)量濃度為0.5～50mg/L的混合標準工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：島津Shim-packVP-ODS C18柱（250×4.6mm，5μm）；流動相：A相為2%甲酸，B相為2%甲酸甲醇；梯度洗脫程序為：0.01～8.00m in維持15%B，8.01～25.00m in 15%～50%B，25.01～40.00維持50%B，40.01～45.00min 50%～90%B，45.01～50.00min 90%～15%B，50.01～60.00m in 15%B；流速：0.7m L/m in；柱溫35℃；進樣量：20μL；檢測波長：280、320、360nm。

1.2.3 樣品的制備 準確稱取過40目篩的金銀花粉末0.25g，加入20m L體積分數(shù)為70%的乙醇溶液，稱定質(zhì)量，于室溫下超聲提取30m in，放冷，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液補足減輕的重量，搖勻，過濾，取濾液置離心機中4000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，上機測定[22-23]。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇 將7種多酚類標準物質(zhì)配制成50mg/L的標準溶液，分別在200～400nm波長范圍內(nèi)進行掃描，各標準物質(zhì)掃描圖譜見圖1。結果顯示，肉桂酸在280nm附近處有最大吸收峰，4種肉桂酸的衍生物：香豆酸、綠原酸、咖啡酸及阿魏酸均在320nm附近有最大吸收峰，而屬黃酮類物質(zhì)的蘆丁和木犀草苷在360nm附近處有最大吸收峰。因此，選擇280nm作為肉桂酸的檢測波長，320nm作為4種肉桂酸衍生物的檢測波長，360nm作為2種黃酮類物質(zhì)的檢測波長。

圖1 7種多酚類化合物紫外吸收光譜圖Fig.1 UV-spectrum of seven phenolic compounds

2.1.2 流動相的選擇 利用高效液相色譜法測定多酚類化合物的流動相通常由甲醇、乙腈等有機溶劑和甲酸、乙酸、三氟乙酸等少量酸性調(diào)節(jié)劑組成[24-25]。分別考察了甲醇-2%甲酸、2%甲酸甲醇-2%甲酸、乙腈-2%甲酸、2%甲酸乙腈-2%甲酸對7種多酚類化合物的分離情況。在所設定的條件下，發(fā)現(xiàn)甲醇-2%甲酸會導致綠原酸等酚酸類物質(zhì)出現(xiàn)拖尾峰，且木犀草苷和蘆丁不能實現(xiàn)有效分離，而2%甲酸甲醇-2%甲酸和2%甲酸乙腈-2%的甲酸溶液作為流動相均可獲得較好的分離效果，但乙腈毒性較大，故選擇2%甲酸甲醇-2%甲酸溶液作為流動相。在該條件下，7種多酚類化合物標樣和金銀花樣品色譜圖見圖2。

圖2 7種多酚類化合物混合標樣（A）和金銀花樣品（B）在280nm處的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sevenmixed phenolic compounds standards（A）and Lonicera japonica（B）at 280nm

表1 不同提取次數(shù)對7種多酚類化合物回收率的影響（%）Table1 Effectof differentextract times on the recoveries of seven phenolic compounds（%）

表2 7種多酚類化合物的保留時間、回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)及檢測限Table2 Retention times，linear equations，correlation coefficients and LOD of seven phenolic compounds

2.2 前處理方法的確立

一般金銀花多酚類化合物的提取采用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液[11，22-23]。本實驗用70%的乙醇溶液按照1.2.3的方法采用超聲對加標樣品分別進行處理1、2、3次，測定其回收率。由表1可知，超聲處理次數(shù)的改變，對7種多酚類化合物回收率的影響不同，其中木犀草甘、蘆丁隨提取次數(shù)的增加，其回收率有所增加，而綠原酸、咖啡酸和香豆酸隨提取次數(shù)的增加，其回收率反而降低。這可能是各多酚類化合物對超聲穩(wěn)定性不同所致[26]。故采用70%乙醇溶液超聲提取1次，各組分提取良好，能滿足提取要求。

2.3 方法評價

2.3.1 線性關系及檢出限 將不同濃度的混合標準品溶液按1.2.2節(jié)的色譜條件進行分析，以測得的各個多酚類化合物積分峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標繪制標準曲線。各多酚類化合物的保留時間、線性方程、線性范圍、相關系數(shù)及方法檢出限如表2所示。7種多酚類化合物的檢出限（RSN=3）為0.001～0.078mg/L，在各多酚類化合物相應的線性范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與積分峰面積呈現(xiàn)出良好的線性關系，相關系數(shù)達到0.9964以上。

2.3.2 精密度及穩(wěn)定性 將同一質(zhì)量濃度標準溶液進行5次日內(nèi)和3次日間測定，記錄峰面積，測得各化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度，實驗結果見表3。方法的日內(nèi)相對標準偏差小于2.33%，日間相對標準偏差小于3.27%，表明分析方法重現(xiàn)性好，結果可靠。

2.3.3 回收率 本實驗采用標準加入法進行方法準確度測定。取已知含量的樣品3份，分別加入一定質(zhì)量濃度的標準品溶液，按1.2.3節(jié)方法處理樣品，在1.2.2節(jié)所述條件下進行測定，以3次進樣測定計算平均值。測定結果如表4所示，各組分的回收率在93.42%～102.53%之間。說明方法加標回收效果較好，可用于金銀花中綠原酸、木犀草苷及咖啡酸等7種多酚類化合物的含量測定。

表3 7種多酚類化合物的精密度（n=5）Table3 Precision of seven phenolic compounds（n=5）

表4 7種多酚類化合物的回收率（n=3）Table4 Recovery rates of seven phenolic compounds（n=3）

2.4 實際樣品分析

對不同花期的金銀花樣品按1.2.3節(jié)方法處理，并在1.2.2節(jié)所述條件下進行測定，各花期金銀花樣品中7種多酚類化合物的含量，如表5所示。由表5可知，金銀花在幼蕾期和三青期中7種多酚類化合物均被檢出，而后香豆酸未被檢出，7種多酚類化合物中含量最高的是綠原酸，其次是蘆丁和木犀草苷。其中綠原酸在各花期中的含量表現(xiàn)為先上升后降低，在二白期含量達到最高，幼蕾期最低，這與劉偉等的研究結果一致[27]，而木犀草苷含量在銀花期達到最高，但總體而言，7種多酚類化合物的總量在二白期最高，達到44.554mg/g，而在幼蕾期最低，為16.988mg/g。

表5 金銀花中7中多酚類化合物的含量（mg/g）Table5 Contents of seven phenolic compounds in Lonicera japonica（mg/g）

3 結論

本實驗建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時測定金銀花中7種多酚類化合物的方法，采用2%甲酸甲醇-2%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，能將7種多酚類化合物有效分離，在此條件下，測定不同花期金銀花中7種多酚類化合物，其含量存在較大差異，二白期含量最高，為44.554mg/g。該方法前處理簡便，靈敏度高、可靠、重現(xiàn)性好，可用于金銀花中7種多酚類化合物含量的檢測，具有實用價值。

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