吳旭麗，童群義

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122）

杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）又稱茶菊，是一種藥食同源的植物，主要產(chǎn)自浙江省桐鄉(xiāng)、海寧、吳興、嘉興等地[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證明杭白菊具有抑菌、抗炎、抗氧化、降血脂、抗心血管疾病的功效[2]。采用現(xiàn)代工藝提取的菊花汁可直接飲用，或經(jīng)進(jìn)一步深加工成濃縮粉、濃縮汁等食品配料，從而提升產(chǎn)品附加值。

制備食用型菊花汁（區(qū)別于藥用），應(yīng)盡量避免或減少使用有機(jī)試劑，減少試劑殘留的危險的同時也可減少溶劑成本。黃酮類物質(zhì)、綠原酸、揮發(fā)油是杭白菊發(fā)揮以上功效的主要活性物質(zhì)[2]。菊花中的黃酮類物質(zhì)大都以苷類形式存在，苷類物質(zhì)易溶于水、乙醇等極性溶劑；綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸組成的縮酚酸，在熱水中溶解度較大；菊花中的揮發(fā)油包含飽和烷烴、醇、烯、醛、酮、酯等物質(zhì)，研究證明，水提菊花汁中至少含有36種揮發(fā)油，占體系總揮發(fā)油種類的99%[3]。因此，以水為溶劑提高食用菊花提取率更有研究意義。

超聲和微波技術(shù)應(yīng)用廣泛,超聲波可破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透性，從而增加物質(zhì)提取率并縮短提取時間[4]；微波萃取是通過微波迅速、均勻加熱以提高提取效率，不同物質(zhì)對微波能的吸收不同，可以實(shí)現(xiàn)選擇性萃取[5]。微波處理可增加黃酮等植物次生代謝產(chǎn)物及芳香物質(zhì)的回收率[6]?；谝陨咸攸c(diǎn)，超聲、微波協(xié)同輔助提取在實(shí)現(xiàn)較高得率的同時減少溶劑用量，從而減少溶劑成本及后續(xù)深加工（如濃縮、干燥等）的能耗和時間。目前傳統(tǒng)的水提法[7]，如常溫浸提、加熱回流以及新型超聲或微波單獨(dú)輔助提取的研究成果較多，但少有超聲、微波協(xié)同水提食用菊花汁及與傳統(tǒng)提取方法的系統(tǒng)比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杭白菊朵菊 購自浙江嘉興市；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%，UV分析純），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%，HPLC分析純） 均購自上海源葉生物科技有限公司；雙圈牌9cm慢速定量濾紙 購自杭州沃華濾紙有限公司；0.22μm水相微孔濾膜 購自上海新亞凈化材料廠；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，95%乙醇，磷酸，磷酸二氫鈉，三氯甲烷，乙酸乙酯 均為分析純；超純水，甲醇 均為色譜純。

FW-80-1高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀 超聲波固定頻率40kHz，功率50W，上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司；UV-2100型紫外分光光度儀 上海龍尼柯儀器有限公司；自動進(jìn)樣高效液相色譜儀日立；Ultimate AQ-C18色譜柱 美國Welch Material, InC.；鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；AB104-N電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FA1004電子天平 上海天平儀器廠；SHZ-D（Ш）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 原料處理與萃取 干燥杭白菊花序用萬能粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，粉末備用。用分析天平準(zhǔn)確稱取2.50g菊花粉末于微波-超聲專用500m L萃取燒瓶中，按1.2.5.1所對應(yīng)料液比加入蒸餾水，浸潤后，分別按1.2.5.2和1.2.5.3所述萃取時間、微波功率條件在超聲微波萃取儀中萃取。萃取完畢，靜置10min，用雙層定量濾紙抽濾2次。濾液用蒸餾水定容至250m L，用于檢測。

1.2.2 總黃酮含量測定

1.2.2.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品17.16mg，用95%乙醇溶解，超聲10min使其完全溶解，并用95%乙醇定容至50m L，配制成0.3432mg/m L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6m L于25m L容量瓶中，并用蒸餾水加至總體積為10mL；加入1mL1.0%NaNO2，搖勻，靜置6min；加入1m L10%Al（NO3)3，搖勻，靜置6min；加入10m L4.0%NaOH，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10min；于510nm下檢測吸光值[8]。以總黃酮濃度為x橫坐標(biāo)，吸光值為y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品總黃酮含量的測定 取各供試液1m L于25m L容量瓶，根據(jù)1.2.2.1中測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定510nm下樣品UV吸光值。吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，并換算出總黃酮提取率（mg/g)。

總黃酮提取率（mg/g)= X1/W ×250

式中，X1為由總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的總黃酮含量，mg；W為菊花粉末質(zhì)量，g；250為測定液與樣液總量的換算指數(shù)。

1.2.3 綠原酸含量測定

1.2.3.1 綠原酸含量測定色譜條件。

色譜柱為AQ-C18（5μm，4.6mm×250mm）；流動相A為1.0%磷酸二氫鈉水溶液（以2m L/L比例添加磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7）；流動相B為甲醇（色譜純）；70%流動相A與30%流動相B等度洗脫30min；流速為1.0m L/min；柱溫30℃；檢測器為DAD紫外檢測器；檢測波長為328nm[9]

1.2.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取19.70mg綠原酸標(biāo)品，用超純水配制成0.1970mg/m L的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。進(jìn)樣量為1、2、3、4、5μL，在1.2.3.1色譜條件下測定不同進(jìn)樣量對應(yīng)的綠原酸峰面積。以綠原酸含量為x橫坐標(biāo)，以峰面積（103)為y縱坐標(biāo)，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 樣品綠原酸含量測定 準(zhǔn)確移取1.2.1中供試液10m L于潔凈已稱重的6cm直徑玻璃皿中，于40℃烘箱放置12h至烘干；加5m L氯仿，浸泡5min，棄氯仿液；加5m L乙酸乙酯，浸泡5min，棄乙酸乙酯，入40℃烘箱1h揮干有機(jī)溶劑，稱重（記為M）；加5mL超純水，待樣品完全溶解后，經(jīng)0.22μm的水相微孔濾膜過濾[10]。按 1.2.3.1的色譜條件測樣品在綠原酸保留時間對應(yīng)的峰面積，進(jìn)樣量為10μL。根據(jù)綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出綠原酸的提取量（mg/g）。

式中，X2為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到綠原酸含量（mg）；W為菊花粉末質(zhì)量，g；12.5為測定液與樣液總量的換算指數(shù)。

1.2.4 固形物提取率測定 固形物提取率反映杭白菊的原料利用率，關(guān)系到成本問題。通過稱量法[11]，可測定固形物提取率。

式中，M0——1.2.3.3中玻璃皿質(zhì)量，g；M為1.2.3.3中揮干有機(jī)溶劑后皿和樣品總質(zhì)量，g；W為菊花粉末質(zhì)量，g；25為測定液與樣液總量的換算指數(shù)。

1.2.5 單因素實(shí)驗 以菊花提取液中總黃酮提取率（mg/g）、綠原酸提取率（mg/g)以及固形物提取率（%)為指標(biāo)，做料液比（g∶m L)、時間（min)、微波功率（w)的單因素實(shí)驗，研究各個因素對菊花提取液質(zhì)量和產(chǎn)量的影響規(guī)律。

1.2.5.1 料液比對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取菊花粉末 2.50g，設(shè)定微波功率300W，提取時間300s，分別加蒸餾水至料液比為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70（g:m L），測定綠原酸、總黃酮、固形物的提取率。

1.2.5.2 微波功率對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取菊花粉末2.50g，加蒸餾水至料液比為1:40，設(shè)定提取時間300s，微波功率分別為0、100、200、300W，測定綠原酸、總黃酮、固形物的提取率。

1.2.5.3 提取時間對提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取菊花粉末2.50g，加蒸餾水至料液比為1:40，設(shè)定微波功率300W，分別設(shè)定提取時間為120、210、300、390、480s，測定綠原酸、總黃酮、固形物的提取率。

1.2.6 正交優(yōu)化實(shí)驗 在單因素研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，以菊花提取液中總黃酮提取率（mg/g）、綠原酸提取率（mg/g)以及固形物提取率（%)為指標(biāo)，料液比（g:m L)、時間（s)、微波功率（W)為主要因素，選取L9（34），按表1進(jìn)行3水平3因素正交實(shí)驗。每個試驗重復(fù)三次。實(shí)驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析。

表1 正交因素水平設(shè)計表Table1 Design of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合分析

2.1.1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如下： y=0.3566x+0.0514， R2=0.9955。

式中，x為總黃酮濃度，mg/m L；y為樣品吸光值。R2＞0.99，方程擬合得到的總黃酮含量結(jié)果可靠。

2.1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程如下：y=12659.8x+81.619，R2= 0.9995。

式中，x為綠原酸含量，μg；y為峰面積，103。R2＞0.99，方程擬合得到的綠原酸含量結(jié)果可靠。

2.2 單因素實(shí)驗分析

2.2.1 料液比對提取率的影響 如圖1和圖2，在1:20～1:50的料液比范圍內(nèi)，總黃酮、綠原酸和固形物的提取率均隨料液比的增加而增大，并在1:50時達(dá)到最大值60.36mg/g、3.81mg/g、47.96%。料液比1:50時各物質(zhì)的提取率已趨于飽和，溶劑量進(jìn)一步增大則影響物質(zhì)的提取。這是因為微波加熱作用下原料的毛細(xì)孔特性增強(qiáng)，使提取溶劑的滲透作用更有效[12]，并且同超聲波一起作用于細(xì)胞，加速其瓦解，從而加快傳質(zhì)速率[13]；物質(zhì)傳遞是物質(zhì)從物料粉末內(nèi)部（固相）向溶劑（液相）擴(kuò)散的過程[14]。當(dāng)溶劑量大，則兩相間的物質(zhì)濃度差大，擴(kuò)散推動力也大，從而更有利于物質(zhì)的溶出；而在1:50以后，溶劑量增大使能量分散，而超聲微波發(fā)生器位于提取瓶下方，液面越高微波超聲功率越弱[13]，整體提取效率比能量集中時弱，因而隨著溶劑量增大提取率略有下降。

總體觀察料液比對總黃酮、綠原酸和固形物的提取率影響不明顯。考慮到后續(xù)濃縮加工、運(yùn)輸?shù)某杀?，盡量選取提取率較高而低料液比的條件。因此，可對1:30～1:50范圍內(nèi)的提取效果做進(jìn)一步研究。

圖1 料液比對總黃酮提取率和綠原酸提取率的影響Fig.1 Influence of solid-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

圖2 料液比對固形物提取率的影響Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on extraction yield of solid content

2.2.2 超聲-微波時間對提取率影響 如圖3，隨提取時間增加，總黃酮和綠原酸的提取率明顯增加，并在210s處分別達(dá)到高峰60.33mg/g和3.85mg/g，而后又顯著下降，并保持在略高于120s時的水平。如圖4，固形物提取率也呈現(xiàn)相似的趨勢，但在210s與300s達(dá)到幾乎相同的水平。其原理是，在微波作用下溶劑溫度會迅速升高，溫度升高可加快分子的運(yùn)動，從而增加物質(zhì)的溶出[10]，但超聲作用會使溶劑中的氣泡破裂，造成局部高溫和高壓，進(jìn)而誘發(fā)酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)的瓦解[13]，因此長時間的微波超聲作用會使黃酮、綠原酸等敏感性物質(zhì)變性的可能性增加，導(dǎo)致紫外下的特征吸收減弱。

300s時固形物提取率雖然較高，但菊花中的重要質(zhì)量指示性物質(zhì)綠原酸和總黃酮有一定的損失。綜合考慮耗能等因素，可對鄰近210s的提取時間做最優(yōu)化實(shí)驗。

圖3 提取時間對總黃酮提取率和綠原酸提取率的影響Fig.3 Influence of extracting time on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

圖4 提取時間對固形物提取率的影響Fig.4 Influence of extracting time on extraction yield of solid content

2.2.3 微波功率對提取率的影響 如圖5、6，微波功率0～200W范圍內(nèi)，隨功率的增加，總黃酮、綠原酸、固形物提取率的增加十分顯著，200W時分別達(dá)到最大值60.07mg/g、3.97mg/g、48.05%；而隨后各指標(biāo)都下降，其中綠原酸含量下降明顯。微波和超聲波能破壞生物細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有效釋放到提取介質(zhì)中。細(xì)胞的瓦解又大大增加了接觸面積，從而增加了物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)到溶劑的傳質(zhì)速率[12]；在一定范圍內(nèi)，微波功率越大，細(xì)胞破碎得越徹底，傳質(zhì)速率的增加越明顯。然而，微波能量能穿透有機(jī)物質(zhì)的碳鏈結(jié)構(gòu)而到達(dá)官能團(tuán)[13]，微波功率過大，可能引起敏感性物質(zhì)的變性。綠原酸、總黃酮、固形物含量的下降說明在此提取條件下，大于200W時微波和超聲的破壞作用可能比提取作用更明顯。

因此，對鄰近200W的微波功率可做進(jìn)一步實(shí)驗研究。

圖5 微波功率對總黃酮提取率和綠原酸提取率的影響Fig.5 Influence of microwave power on extraction yield of total flavonoids and chlorogenic acid

圖6 微波功率對固形物提取率的影響Fig.6 Influence of microwave power on extraction yield of solid content

2.3 正交實(shí)驗結(jié)果與討論

以總黃酮、綠原酸、固形物提取率為菊花提取液的評價指標(biāo)，3因素3水平正交實(shí)驗結(jié)果及分析見表2。極差分析結(jié)果表明，各因素對三個指標(biāo)影響大小順序相同，均為 A＞B＞C，即微波功率是影響各物質(zhì)提取率最重要的因素，提取時間次之，料液比影響最小。這與單因素所得趨勢吻合。

方差分析結(jié)果（表3）表明，對于綠原酸和總黃酮的提取率，僅微波功率（A）的不同水平會產(chǎn)生顯著差異；對于固形物含量，微波功率（A）和提取時間（B）的不同水平均會產(chǎn)生顯著差異。使總黃酮、綠原酸、固形物提取率最大化的提取條件分別為A3B2C2、A3B3C2、A3B3C1。

總黃酮和綠原酸是菊花提取液中最重要的功能性物質(zhì)，也是工業(yè)上評價菊花產(chǎn)品質(zhì)量的主要理化指標(biāo)；在總黃酮和綠原酸提取率對應(yīng)的最佳水平下，固形物提取率較可觀；由于料液比的影響不顯著，又從節(jié)水、節(jié)省空間、方便運(yùn)輸和后續(xù)加工的角度考慮，同等提取效果下選擇低料液比條件為佳。因此，經(jīng)綜合評價，將最佳組合確定為A3B3C1，即250W、240s、1:30。

對正交實(shí)驗確定的最佳條件進(jìn)行驗證，試驗重復(fù)三次。結(jié)果表明，250W、240s、1:30的條件下，總黃酮提取率為62.20±0.30mg/g，綠原酸提取率為4.05± 0.06mg/g，固形物提取率50.75±0.3%。結(jié)果較理想，證明正交實(shí)驗結(jié)果可靠。

表2 正交實(shí)驗結(jié)果與分析Table2 Result and analysis of orthogonal experiment

表3 正交實(shí)驗方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experiment

注：*表示差異顯著，p＜0.05.

2.4 提取方法比較

為了證明超聲-微波協(xié)同提取法的優(yōu)越性。在相同實(shí)驗室環(huán)境下，用幾種常規(guī)提取方法制備杭白菊水提液，并與本論文所研究的方法進(jìn)行比較。所用料液比均為1:30（g:m L）。提取條件及結(jié)果如表4所示。

由表4可知，超聲微波協(xié)同輔助法的提取效率明顯高于傳統(tǒng)提取法和單獨(dú)的超聲/微波輔助法。其中，熱回流法的提取效率較高，略低于超聲微波法，但后者的提取時間是前者的1/30。短時間的單獨(dú)超聲輔助的提取效率略高于常溫浸提，但不如熱回流和含微波過程的提取方法。相比于效率較高、應(yīng)用較廣泛的傳統(tǒng)熱回流，超聲微波法的總黃酮提取率提高了5.98%，綠原酸提取率提高4.09%，總固形物含量提高13.74%，并大大縮短了提取時間。

3 結(jié)論

通過單因素和正交實(shí)驗確定微波功率250W，提取時間240s、料液比1:30（g:m L）的條件下，杭白菊的提取效率最高：總黃酮提取率達(dá)（62.20±0.30）mg/g，綠原酸提取率達(dá)（4.05±0.06）mg/g，固形物提取率50.75%±0.3%。

與浸提法、熱回流法、微波輔助法比較，利用超聲-微波協(xié)同制備杭白菊水提液，可以在較低的料液比下獲得較高的提取率，同時縮短提取時間，減少有效物質(zhì)的損失。本實(shí)驗方法制得的菊花水提液總黃酮和綠原酸含量高，可作為菊花濃縮汁、菊花濃縮粉的原材料。雖然目前微波-超聲協(xié)同萃取實(shí)現(xiàn)工業(yè)化還存在一定的困難，但本實(shí)驗所得到的參數(shù)可為工業(yè)化研究提供一定的參考。

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