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（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

全球H5N1亞型流感病毒NA和NS基因進(jìn)化趨勢(shì)

李彥芳，張治業(yè)，宋慶慶，顧 敏，陳素娟，彭大新，劉秀梵

（揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

為了探討全球H5N1亞型流感病毒（IV）NA和NS基因的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，本文從NCBI下載1996-2013年全球H5N1 IV的NA、NS基因序列并進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示NA和NS雙基因部分缺失株在H5N1亞型IV中占有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，NA和 NS基因部分缺失能顯著影響毒株間的遺傳距離，2010年后分離的H5N1亞型IV的NA基因優(yōu)勢(shì)流行基因型是Group-6 like，NS基因優(yōu)勢(shì)流行基因型為Group-2 like。

H5N1亞型；流感病毒；NA基因；NS基因；缺失

流感病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，為了適應(yīng)環(huán)境和宿主的變化，極易發(fā)生變異，而其中一些適應(yīng)株會(huì)在不斷的進(jìn)化過(guò)程中得以生存和保留。H5N1亞型禽流感病毒（AIV）早期水禽源的代表株A/Goose/Guangdong/1/96 具有完整的NA和NS基因。近年來(lái)，H5N1亞型AIV的NA莖部在49-68位出現(xiàn)了20個(gè)氨基酸的缺失（Δ NA），其NS1蛋白在80-84位出現(xiàn)了5個(gè)氨基酸的缺失（Δ NS），研究者們發(fā)現(xiàn)自2003年以來(lái)，大多數(shù)H5N1亞型流感病毒都有 Δ NA[1-3]和 Δ NS[4-7]這兩種缺失現(xiàn)象。但是對(duì)于Δ NA、Δ NS這兩種缺失現(xiàn)象在H5N1亞型流感病毒中首次出現(xiàn)的時(shí)間、宿主來(lái)源差異、現(xiàn)今流行情況等分子流行病學(xué)信息還不是很清楚。有鑒于此，本文對(duì)1996—2013年之間GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的所有H5N1亞型流感病毒代表株的NA和NS基因序列進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析及分子遺傳進(jìn)化分析，旨在了解近十幾年來(lái)全球H5N1亞型流感病毒的NA和NS基因部分缺失的分子流行病學(xué)特點(diǎn)和遺傳進(jìn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 H5N1亞型流感病毒的序列來(lái)源

我們從NCBI網(wǎng)站上的流感病毒專用數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/ Database/nph-select.cgi?go=database）下載了1996-2013年之間全球H5N1亞型流感病毒代表株的NA、NS基因序列。這些毒株同時(shí)具有NA和NS基因序列。

1.2 對(duì)所下載毒株的NA和NS基因的部分氨基酸缺失情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析

以A/Goose/Guangdong/1/96 作為參考毒株，其NA和NS基因均未發(fā)生氨基酸缺失現(xiàn)象，屬于NA和NS基因均未缺失株（NANS）。以A/ mallard/Huadong/S/2005[8]作為另一個(gè)參考毒株，其NA莖部在49-68位發(fā)生了20個(gè)氨基酸的缺失，NS1蛋白在80-84位發(fā)生了5個(gè)氨基酸的缺失，屬于NA和NS雙基因部分缺失株（Δ NA Δ NS）。

將所下載毒株的NA和NS基因序列用MegA-lign進(jìn)行多序列比對(duì)分析，記錄各個(gè)毒株的NA和NS蛋白是否有部分氨基酸缺失情況，分類為NANS、 NA單基因缺失株（Δ NANS）、NS單基因缺失株（NA Δ NS）、Δ NA Δ NS，統(tǒng)計(jì)各類毒株的時(shí)間分布情況、宿主來(lái)源情況，并計(jì)算出Δ NA Δ NS所占的百分比。

1.3 序列的編輯、比對(duì)以及遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制

使用DNASTAR Lasergene7.1版本軟件中的EditSeq 與MegAlign模塊對(duì)所下載的序列進(jìn)行編輯、拼接和比對(duì)。用Bioedit 7.0軟件編輯所下載的序列，刪除一些不完整的基因序列，將所有序列剪輯成等長(zhǎng)，便于后期遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制。采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 5.0軟件中的鄰接距離法（Neighbor-joining，NJ）生成遺傳進(jìn)化樹(shù)，分支處的數(shù)值表示1000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)的百分率數(shù)值，標(biāo)尺顯示序列兩兩之間的進(jìn)化距離[9]。用 MEGA 5.0 軟件計(jì)算種群平均變異率，依據(jù)遺傳距離小于種群平均變異率的毒株歸于一個(gè)分支的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)遺傳進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分組。

2 結(jié)果

2.1 歷年來(lái)H5N1亞型流感病毒的NA和NS基因部分缺失情況

為了使所下載的序列信息能最大限度地接近于H5N1亞型流感病毒的整個(gè)群體情況。我們將流感毒株名稱中“型別/宿主/分離地點(diǎn)/毒株編號(hào)/分離年代” 除了毒株編號(hào)不同之外，其余信息都完全相同的分離株默認(rèn)為一個(gè)子代病毒群，僅隨機(jī)下載其中的一個(gè)毒株序列，作為該群的代表毒株。我們共下載了949株H5N1亞型流感病毒的NA和NS基因序列，分別來(lái)源于家禽、野生禽類、哺乳動(dòng)物和環(huán)境。樣本來(lái)源分析顯示，57%的H5N1亞型流感病毒來(lái)源于家禽，28.9% 的毒株來(lái)源于野生禽類，表明家禽是H5N1亞型流感病毒的主要宿主，其次是野生禽類。

與參考毒株的相應(yīng)基因比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：1997年首次出現(xiàn)了Δ NANS，而NA Δ NS首次出現(xiàn)的時(shí)間是2000年，Δ NA Δ NS首次出現(xiàn)的時(shí)間是2002年。值得注意的是，在Δ NA Δ NS出現(xiàn)的第二年，即2003年，Δ NA Δ NS已占當(dāng)年所有H5N1亞型流感病毒的76.1%，而到2004年時(shí)，Δ NA Δ NS所占的比例已高達(dá)90%，隨后一直保持在相對(duì)穩(wěn)定的水平上，成為H5N1亞型流感病毒的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行株（表1）。分析還發(fā)現(xiàn)，NA和NS基因部分缺失現(xiàn)象分別占雞源H5N1亞型AIVs的96.2%和94.9%；占野生禽源 H5N1 亞型AIVs的93.3%和94.1%；占鴨源 H5N1 亞型AIVs的81.2%和81.8%；占鵝源H5N1亞型AIVs的51.2%和69.8%。

2.2 NA基因以及NS基因的遺傳進(jìn)化分析

1996年的H5N1亞型流感病毒僅有1株病毒A/Goose/Guangdong/1/96，該病毒具有完整的NA和NS基因。1997年共有13株H5N1亞型流感病毒，按照區(qū)域和宿主來(lái)源是否相同的標(biāo)準(zhǔn)，至少可分為湖北雞源、廣東鵝源、香港雞源、香港人源、香港環(huán)境共5個(gè)群；而按照NA莖部氨基酸是否缺失以及缺失的位置是否相同的標(biāo)準(zhǔn)，可分為NA莖部未缺失、NA莖部在49-68位缺失20個(gè)氨基酸、NA莖部在55-74位缺失20個(gè)氨基酸、NA莖部在55-73位缺失19個(gè)氨基酸共4個(gè)群。由此看來(lái)，A/Goose/Guangdong/1/96-like 的H5N1亞型流感病毒在第2年就在不同宿主、不同地區(qū)流行起來(lái)，并且NA基因型也相對(duì)復(fù)雜。

表1 1996—2013年全球H5N1亞型流感病毒的NA、NS基因部分缺失情況統(tǒng)計(jì)分析

圖1 H5N1亞型流感病毒的NA基因進(jìn)化樹(shù)

H5N1亞型流感病毒NA基因的種群平均變異率為3.5%，根據(jù)序列之間的遺傳距離小于3.5%歸屬于同一分支的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將NA基因遺傳進(jìn)化發(fā)生樹(shù)劃分為 6個(gè)分支。由于進(jìn)化樹(shù)過(guò)于龐大，在每個(gè)分支中隨機(jī)選出1/5的毒株序列繪制了一個(gè)小進(jìn)化樹(shù)（圖1）。其中NA莖部未缺失的毒株分處于3個(gè)獨(dú)立的分支上；而 NA莖部缺失的毒株則分布于其余的3個(gè)分支中。2010年后分離的H5N1亞型流感病毒的NA基因主要集中在5、6分支上，其中分支6中流行株最多，可能是近年來(lái)H5N1亞型流感病毒NA基因的主要優(yōu)勢(shì)流行基因型。

H5N1亞型流感病毒NS基因的種群間平均變異率為2.5%，根據(jù)序列之間的遺傳距離小于2.5%歸屬于同一分支的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將NS基因的遺傳進(jìn)化發(fā)生樹(shù)劃分為7個(gè)分支。同樣在每個(gè)分支中隨機(jī)選出1/5的毒株序列繪制了一個(gè)小進(jìn)化樹(shù)（圖2）。其中NS基因未缺失的毒株主要集中在1和5分支上；而 NS1蛋白在80-84位缺失5aa的毒株則分布于其余的5個(gè)分支中。2010—2012年之間分離的大多數(shù)H5N1亞型流感病毒的NS基因主要集中在2、4、7這3個(gè)三支上，其中分支2中的流行株最多，可能是近年來(lái)H5N1亞型流感病毒NS基因的主要優(yōu)勢(shì)流行基因型。絕大多數(shù)人源H5N1亞型流感病毒都屬于Δ NA Δ NS，并且毒株較為分散地位于遺傳進(jìn)化樹(shù)的主要分支內(nèi)，都與某些禽源毒株的同源性較高。對(duì)NA和NS基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，NA基因處于相鄰位置的大多數(shù)H5N1亞型流感病毒的NS基因也處于相鄰位置。

3 討論

圖2 H5N1亞型流感病毒的NS基因進(jìn)化樹(shù)

流感病毒的NA莖部缺失現(xiàn)象較為多見(jiàn)。迄今為止，N1亞型流感病毒的NA莖部氨基酸模式大致有以下6種情況：莖部沒(méi)有氨基酸缺失（A/Gs/ GD/96/H5N1-like）；在57-72位缺失16個(gè)氨基酸（A/ WSN/33/H1N1-like）；在63-77位缺失15個(gè)氨基酸（A/PR8/34/H1N1-like）；在55-73位缺失19個(gè)氨基酸（A/HK/97/ H5N1-like）；在54-75位缺失22個(gè)氨基酸（A/ Ck/Italy/99/H7N1-like）；在49-68位缺失20個(gè)氨基酸（Δ NA）[10-11]。自2003年以來(lái)，Δ NA已成為H5N1高致病性禽流感病毒的特征性標(biāo)志，大多數(shù)研究學(xué)者從流行病學(xué)角度推測(cè)認(rèn)為 Δ NA是H5N1亞型AIV從水禽向陸生禽類進(jìn)化的適應(yīng)性分子標(biāo)志[1-3]。非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）基因的核酸序列在進(jìn)化上分為A和B兩個(gè)系，同系間毒株的同源性為 93-100%；而不同系之間的毒株同源性卻只有62%左右[12-13]。在2000年，H5N1亞型AIV 的NS1蛋白在80-84位出現(xiàn)了5個(gè)氨基酸的缺失[6]，而2001年以后，除了基因型X0-X3的毒株外，幾乎所有的H5N1亞型流感病毒都有Δ NS缺失現(xiàn)象[4-7]。

本研究對(duì)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中歷年來(lái)的H5N1亞型流感病毒分離株的NA 和NS基因部分缺失情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示H5N1亞型流感病毒的NA、NS基因部分缺失現(xiàn)象在不同宿主中的分布情況有所差異，雞源分離株中NA、NS基因缺失現(xiàn)象最普遍，水禽源的比例略低，這表明Δ NA和 Δ NS缺失現(xiàn)象很可能都是H5N1亞型AIV從水禽向陸生禽類進(jìn)化的適應(yīng)性分子標(biāo)志。2004年以后，Δ NA Δ NS所占的比例都維持在90%左右，這表明Δ NA Δ NS在H5N1亞型流感病毒中占有絕對(duì)的生存優(yōu)勢(shì)[3，6-7，10]。由此推測(cè)，與NANS、Δ NANS和NA Δ NS相比，Δ NA Δ NS可能具有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)，具體的機(jī)制和生物學(xué)意義還有待于進(jìn)一步研究。

從歷年H5N1亞型流感病毒的NA和NS基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)中可以看出，NA基因部分缺失株與NA基因未缺失株所在的分支相對(duì)獨(dú)立，且NS基因部分缺失株與NS基因未缺失株所在的分支也相對(duì)獨(dú)立，這表明Δ NA和Δ NS缺失現(xiàn)象能顯著影響H5N1亞型流感病毒之間的遺傳距離。由于2010年后分離的大多數(shù)H5N1亞型流感病毒的NA基因位于分支6中，而NS基因則位于分支2中，并且NA基因處于相鄰位置的大多數(shù)病毒的NS基因也處于相鄰位置。因此，我們推斷自2010年以來(lái)，H5N1亞型流感病毒的NA基因主要優(yōu)勢(shì)流行基因型是Group-6 like，NS基因主要優(yōu)勢(shì)流行基因型為Group-2 like，并且病毒NA和NS基因的進(jìn)化是同步的。

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Global Evolution Trend of NA and NS Genes of H5N1 Subtype Infuenza Viruses

Li Yanfang，Zhang Zhiye，Song Qingqing，Gu Min，Chen Sujuan Peng Daxin，Liu Xiufan

（Key Laboratory of Animal Infectious Disease，Ministry of Agriculture； Key Laboratory for Avian Preventive Medicine，Ministry of Education； College of Veterinary Medicine，Yangzhou University， Yangzhou，Jiangsu 225009）

To elucidate the molecular epidemiological characteristics of NA and NS genes of H5N1 subtype infuenza viruses in the world，the sequences of NA and NS genes of H5N1 subtype infuenza viruses from 1996 to 2013 were downloaded from NCBI database，and the phylogenetic tree was constructed. The results showed that H5N1 viruses with partial deletions in both NA and NS protein became the prevailing strains worldwide. The deletions in NA and NS proteins affected the genetic distance. In particular，H5N1 viruses isolated since 2010 possessed Group-6 like NA gene and Group-2 like NS gene.

H5N1 subtype；infuenza virus； NA gene；NS gene； deletion

S855.3 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C

C

1005-944X（2014）07-0025-05

973計(jì)劃（2011CB505003）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2012ZX10004214-001-002）；江蘇省自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（10KJA230055）；江蘇省研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（CXLX11_1031）；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目（蘇教師[201027號(hào)]）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（IRT0978）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

彭大新，劉秀梵