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（1.廈門波生生物有限公司，福建廈門 321026；2. 廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 321026）

萊克多巴胺的化學發(fā)光免疫測定法試劑盒的研究

沈浩龍1，陳巧欽1，張長弓1，何瓊1，張慧1，徐竟波1，郭書林2，黃印堯2

（1.廈門波生生物有限公司，福建廈門 321026；2. 廈門出入境檢驗檢疫局，福建廈門 321026）

本研究通過制備萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）高活性單克隆抗體，用辣根過氧化物酶（HRP）標記RAC，以魯米諾（luminol）為發(fā)光底物，建立直接競爭法檢測萊克多巴胺。并對包被液、包被條件、包被蛋白濃度、封閉蛋白種類、孵育時間和酶用量等參數進行優(yōu)化，成功研制出了化學發(fā)光檢測RAC的試劑盒。該方法的線性檢測范圍可達到0.1ng/mL—10ng/mL；線性相關系數r=0.998，IC50值為0.6763ng/mL；理論檢測限小于0.1ng/mL。批內變異系數為7.62%～8.65%；批間變異系數為8.15%；回收率在85%±15%之間，與克倫特羅等其它β-受體激動劑不發(fā)生交叉反應。

萊克多巴胺（RAC）；化學發(fā)光免疫測定法（CLIA）；試劑盒

萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）屬于β-受體激動劑類藥物中的苯乙醇類衍生物，具有改善動物飼料利用效率，顯著提高胴體瘦肉率的生產性能，因為其具有嚴重的副作用，對人體危害很大，所以目前該類藥物在我國和其他多個國家是被禁用的。目前對萊克多巴胺的檢測方法有高效液相色譜-質譜聯用法（ HPLC-MS ）和氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[1]，這些檢測方法不能滿足市場監(jiān)督需快速、簡便、價廉的要求?；瘜W發(fā)光免疫測定法（Chemiluminesent Immunoassay，CLIA）具有酶聯免疫檢測的全部優(yōu)點，并且較好地克服了酶聯免疫精密性差的缺點，不易出現假陽性和假陰性結果。該方法具有簡便、快速、靈敏、高特異性、精密性好等優(yōu)點，而且不需要復雜的儀器設備，是目前免疫學檢測方法中最先進，定量最準確的方法之一[2]。

萊克多巴胺CLIA檢測試劑盒的研制，需要獲取RAC單克隆抗體。方法是先將半抗原RAC與大分子載體蛋白交聯，刺激小鼠產生特異性免疫應答，獲取RAC的單克隆抗體。萊克多巴胺 CLIA試劑盒的原理是抗原抗體反應，酶標板包被有RAC的抗體 ，加入含RAC的樣品或標準品，及酶標抗原。標樣或試樣中RAC與辣根過氧化物酶標記抗原競爭與包被的特異性抗體相結合，通過洗滌以除去沒有與抗RAC的特異性抗體結合的酶標記抗原 ，加入魯米諾（luminol）發(fā)光底物，結合到酶標板上的酶標記物將底物催化發(fā)光，在463nm處檢測發(fā)光值，發(fā)光值與樣品中的鹽酸萊克多巴胺濃度成反比。

1 材料

1.1 試劑

鹽酸萊克多巴胺（武漢遠城科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）（華生生物有限公司）；96孔酶標板、細胞培養(yǎng)板、HT、HAT購自Gibco；其它常用有機試劑、無機試劑均為分析純級。

1.2 儀器

BHP9504型微孔板發(fā)光分析儀（北京濱松光子） 。

1.3 實驗動物

BALB/C小鼠購自長春生物制品所試驗動物中心。

2 方法

2.1 RAC人工抗原的合成與鑒定

2.1.1 RAC人工抗原的合成[3]

以多元酸酐與混合酸酐聯用法合成免疫抗原RAC-BSA。偶聯物于磷酸鹽緩沖液（PBS）中透析3d，過SephadexG-25層析柱提純，凍干后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 人工合成抗原的鑒定

2.1.2.1 SDS-PAGE分析 選擇濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色，用凝膠成像儀成像并進行分析。2.1.2.2 紫外分光光度法分析 用考馬斯亮藍G-250法測定RAC-BSA蛋白質的濃度，據此濃度調節(jié)RAC-BSA溶液中蛋白質的濃度與BSA的標準溶液一致，在200-400nm波長處進行紫外可見光吸收波長掃描，觀察三者紫外可見光吸收光譜的關系，根據朗伯-比爾定律計算各自的摩爾消光系數ε，由下列公式計算分子結合摩爾比：半抗原與載體的結合比=（ε結合物－ε載體蛋白）/ε半抗原。

2.2 RAC單克隆抗體的制備[4]

2.2.1 小鼠免疫 準備好的RAC-BSA免疫抗原用PBS稀釋到適當濃度，加入等體積的完全弗氏佐劑（CFA）或者不完全弗氏佐劑（IFA）混合并充分乳化。選9周齡BALB/c小鼠，將200ug CFA抗原皮下分點注射。以后每2-3周用100ug IFA抗原進行一次加強免疫，共免疫5次。細胞融合前3d—5d選取抗體水平最高的小鼠進行超強免疫。

2.2.2 雜交瘤細胞株的建立

2.2.2.1 脾細胞的獲取 取超強免疫4d的小鼠，無菌取脾臟，制備脾細胞。

2.2.2.2 細胞融合 經細胞計數后，脾細胞和瘤細胞（按5：1）混合，用PEG法進行細胞融合，加入HAT選擇培養(yǎng)基，打散融合細胞后分裝到96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100μL，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.2.3 陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆 用間接ELISA法以RAC-BSA包被微孔板檢測陽性孔，當OD450值大于1時，判定為陽性孔。在連續(xù)三次亞克隆的篩選陽性率均為100%時，不再進行亞克隆。

2.2.2.4 單克隆抗體腹水的制備與提純 將陽性克隆接種BALB/C小鼠腹腔制備腹水，待小鼠腹部明顯膨大時抽取腹水。采用辛酸-硫酸銨法粗提腹水單克隆抗體，然后以Sephadex G-150柱純化。

2.2.3 RAC單克隆抗體的鑒定

2.2.3.1 單克隆抗體ELISA效價的測定 采用間接ELISA檢測方法，將雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水從1：100開始倍比稀釋，同時設陰性對照。以吸光值1.0左右，P/N≥2.1的抗體最大稀釋度作為效價終值。

2.2.3.2 單克隆抗體活性鑒定 將RAC-BSA結合抗原和陰性對照BSA噴布于NC膜上；37℃固定40min；加入RAC單克隆抗體IgG膠體金溶液，室溫反應10min；用PBST充分洗滌后觀察結果。

2.2.3.3 單克隆抗體分型鑒定 用單克隆抗體分型試劑盒按要求進行單克隆抗體的測定、分型，測定抗萊克多巴胺單克隆抗體的類型為IgG1。

2.3 檢測方法的建立

2.3.1 RAC抗體包被 用一定濃度的RAC抗體包被微孔板，置冰箱中過夜，倒出孔內液體，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3次，用1% BSA進行封閉。

2.3.2 加樣品及標準品 先加樣品或標準品到各自的微孔中 ，再加入適當濃度的HRP酶標RAC抗原，在微型振蕩器上充分混勻，避光孵育足夠的時間，倒出孔內液體，洗掉游離成份，加入底物液，HRP催化底物發(fā)光。用化學發(fā)光儀測定各樣品孔發(fā)光值RLU，樣品RLU與RAC濃度呈負相相關。

2.3.3 結果判定 以抑制率，即[1-（B/B0）]×100%為縱坐標（其中B為加入不同濃度的RAC標準溶液所測發(fā)光值（RLU），B0為不含RAC所測發(fā)光值（RLU）），RAC各標準溶液濃度為橫坐標，繪制RAC單克隆抗體直接競爭CLIA標準抑制曲線，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中萊克多巴胺實際濃度。

3 結果與討論

3.1 結果

3.1.1 RAC人工合成抗原的鑒定

3.1.1.1 SDS-PAGE分析 偶聯物RAC-BSA的SDS-PAGE結果見圖1。從圖中可以看出，RACBSA偶聯物的條帶略滯后于低分子量蛋白標準中BSA的位置，說明有半抗原連接到BSA上，從而使其分子量增大。

圖1 RAC-BSA偶聯物的SDS-PAGE鑒定

3.1.1.2 紫外分光光度法分析 從紫外全波長掃描結果（圖2）可見BSA的特征波長為278nm，萊克多巴胺的最大吸收波長為274nm。與載體蛋白相比，偶聯物RAC-BSA的最大吸收峰左移，特征波長為276nm，證明人工抗原偶聯成功。依據朗伯-比爾定律，推算出RAC與BSA的偶聯比為25：1。

圖2 RAC-BSA 的紫外掃描結果

3.1.2 RAC單克隆抗體的鑒定

3.1.2.1 單克隆抗體ELISA效價測定 采用間接ELISA檢測方法對RAC單克隆抗體效價進行測定。試驗重復3次，雜交瘤細胞上清抗體效價達到1：25600，腹水抗體效價達到1：409600。

3.1.2.2 單克隆抗體活性鑒定 試驗結果如圖3所示，在RAC-BSA抗原位置出現明顯的棕紅色條帶，而陰性對照BSA位置無條帶出現，證明單克隆抗體對相應抗原具有較好的活性。

圖3 萊克多巴胺單抗的活性鑒定

3.1.3 檢測方法的建立

3.1.3.1 包被條件的確立 分析影響包被效果的因素，有包被緩沖液組分、包被過程溫度、時間等。設計試驗分析以上諸因素的影響，重復2～3次，選擇最優(yōu)包被條件。參比品選用兩份，一份陰性豬尿和該陰性豬尿配制的10ng/mL的萊克多巴胺溶液，結果比較時選取陰性豬尿與10ng/mL的萊克多巴胺豬尿溶液發(fā)光值比值較大，同時陰性豬尿發(fā)光值較高的一組。按正交表L4（23）安排試驗，實驗結果 ：萊克多巴胺抗體選用pH 9.5 CB進行包被，包被條件為4℃ 24h，封板液中使用1% BSA進行封閉。

3.1.3.2 加樣操作模式的確定 操作模式中，樣品酶用量、孵育時間、溫度等均需確定，按正交表L4（23）安排試驗，實驗結果：選定37℃恒溫孵育30min，酶用量為100μL RAC-HRP標記物。

3.1.3.3 包被抗體與RAC-HRP酶使用最佳濃度調配 使用2μg/mL，4μg/ mL，6μg/mL，8μg/ mL濃度RAC抗體包被微孔板，使用1：1000，1：2000，1：3000，1：6000 RAC-HRP酶使用濃度，以0ng/mL發(fā)光值（RLUMAX）/IC50的比值作為評價各影響因素的標準，比值越大則代表靈敏度越高，據此選擇最合適的包被濃度及酶使用濃度。實驗結果：選擇使用4μg/mL RAC抗體包被微孔板，酶濃度使用1：3000。

3.1.4 性能分析

3.1.4.1 標準曲線的繪制 優(yōu)化各檢測條件后，建立定量檢測的直接競爭CLIA方法和標準曲線（重復5次），由實驗結果得出在0.1ng/mL—10ng/mL范圍內標準曲線線性良好r=0.998。以抑制率，即[1-（B/B0）]×100%為縱坐標（其中B為加入不同濃度的RAC標準溶液所測發(fā)光值（RLU），B0為不含RAC所測發(fā)光值（RLU）），RAC各標準溶液濃度為橫坐標，繪制出RAC單抗的直接競爭CLIA標準抑制曲線（圖4）。由圖可見，在0.1 ng/mL到10ng/mL濃度范圍內，單克隆抗體對RAC的標準抑制曲線線性良好，IC50為0.763 ng/mL。

圖4 RAC單克隆抗體標準抑制曲線

3.1.4.2 靈敏度分析 樣本的檢測限是靈敏度的一個評價指標。根據實驗要求，取3批不同批次的試劑盒，測定20個陰性豬尿樣本。根據標準曲線求出測定結果，計算出平均值，加上3倍標準差，即為檢測限。實驗結果表明不同批次的試劑盒在陰性豬尿中萊科多巴胺殘留的檢測限分別為0.045ng/ mL、0.038ng/mL、0.039ng/mL，均小于0.1ng/mL。

3.1.4.3 單克隆抗體的交叉反應性 將萊克多巴胺與其它β-受體激動劑（表1）進行交叉反應實驗。以單克隆抗體對RAC的50%抑制濃度（IC50）與對競爭物的IC50之比的百分數為其交叉反應率（CR%）。用直接競爭化學發(fā)光法（CLIA）測定各競爭物在1-10000 ng/mL時的發(fā)光值（RLU），擬合競爭曲線，并計算RAC及其競爭物的IC50和CR%。RAC單抗對類似結構的β-激動劑交叉反應率如表1所示，除與具有相同雙苯烷胺結構的多巴酚丁胺有7.78%的交叉反應外，與克倫特羅、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺等幾乎沒有交叉反應。

表1 萊克多巴胺與其它β- 受體激動劑的交叉反應結果

3.1.4.4 批內及批間精密度 選取標準曲線50%抑制濃度（IC50）附近濃度的標準溶液（1 ng/mL）重復測定，同一試劑盒測定20個平行，并同時檢測3個不同批次的試劑盒，計算試劑盒批內批間變異系數，結果見表2，其測定結果的批內變異系數在7.62%～8.65%，批間變異系數為8.15%。

表2 萊克多巴胺標準溶液（1ng/mL）的測定結果及批內批間變異系數（n=20個重復×3批）

表3 萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒與拜發(fā)酶免試劑盒盲樣檢測結果比較（單位：ng/mL）

表4 萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒與氣質聯用盲樣檢測結果比較（單位：ng/mL）

表5 不同批次試劑盒在不同測定時間的IC50值

3.1.4.5 準確度分析 取1份低值陽性豬尿，分成4等份，向其中3份添加萊克多巴胺，添加濃度分別為0.1 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL。分別用三個不同批次的試劑盒，每一批試劑盒平行測定陽性豬尿及添加萊克多巴胺的3份樣本各5孔，分別計算均值及回收率。實驗結果表明各添加濃度的回收率均在85±15%之間。

3.1.5 與德國拜發(fā)試劑盒比較 采用盲樣進行比對，隨機抽取16份豬尿盲樣，使用萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒和拜發(fā)酶免試劑盒進行檢測對比，統計比對結果見表3，對比結果可知萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒與拜發(fā)酶免試劑盒對同一樣品的測定值基本一致。

3.1.6 與氣質聯用檢測比較 采用盲樣進行比對，隨機抽取16份豬尿盲樣，使用萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒和氣質聯用進行檢測對比，統計比對結果見表4。對比結果可知萊克多巴胺化學發(fā)光檢測試劑盒與氣質聯用對同一樣品的測定值基本一致。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗 取3批次試劑盒（20091202、20091204、20091207），分別于第0、1、2、3、6、9、12月取樣，對6個標準品進行測定，計算出每條標準曲線的IC50（表5），由表5可知，在保存的12個月內，本試劑盒IC50波動范圍在0.590～0.895ng/mL之間。

3.2 討論

本研究就所制備的RAC單克隆抗體的效價、特異性、半數抑制濃度（IC50）、抗體亞型等進行了初步檢測與鑒定。結果顯示，本研究所建立的雜交瘤細胞株細胞培養(yǎng)上清中單克隆抗體間接ELISA效價為25600，腹水中單克隆抗體的間接 ELISA效價為409600；與禁用藥物克倫特羅等β-受體激動劑不發(fā)生交叉反應。通過對單克隆抗體特性的鑒定，證明所獲得的雜瘤細胞株可穩(wěn)定的分泌效價高、特異性強、敏感性高的IGg1亞類的單克隆抗體，為進一步化學發(fā)光免疫學分析的研究奠定了基礎。

針對RAC建立一種特異、敏感、重復性好的標準化CLIA操作方法是本研究的最終目的，但影響方法準確性的因素較多，在本研究中，我們確定了抗體包被濃度，包被緩沖液，包被條件；封閉蛋白種類；孵育時間；酶用量及濃度。全面驗證CLIA法檢測萊克多巴胺的靈敏度、精密度與準確度。從而達到CLIA檢測試劑盒質量控制的目的：線性檢測范圍可達到0.1ng/mL—10ng/mL，IC50值為0.763ng/mL；理論檢測限小于0.1ng/mL；批內批間變異系數均小于10% ；回收率在85±15%之間；同時有較高的特異性，不受克倫特羅、沙丁胺醇等同屬β-受體激動劑類藥物的影響。該方法步驟簡便，檢測范圍寬，特異性高，完全符合RAC殘留檢測的要求。2011年底，本試劑盒在華南農業(yè)大學獸藥殘留國家基準實驗室檢驗獲得認可。

[1] 王雪霞，劉曉云，彭運平.萊克多巴胺殘留檢測方法及其進展[J].現代食品科技，2010，9（26）：1009-1012.

[2] 楊香瑜，黃鶴.鹽酸克倫特羅完全抗原的合成及歐聯工藝的優(yōu)化[J].高校化學工程學報，2009，20（5）：424-429.

[3] 張紅琳，陳昌云，周紅霞，等.抗萊克多巴胺多克隆抗體的制備[J].湖北農業(yè)科學，2011，9（50）：1836-1847.

[4] 劉建，梅琳，林祥梅，等.萊克巴胺單克隆抗體的制備及競爭性ELISA檢測方法的建立[J].檢驗檢疫科學學，2008，5（18）：53-56.

[5] 呂世靜.臨床免疫學檢驗展[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社.2004，178-190.

[6] David V，Saez R M，Mateo J V，et al. Enhanced chemiluminescent determination of chloramphenicol and related nitro compounds by on-line photochemical reaction[J]. Analyst，2000，125：1313-1319.

[7] Magliulo M，Mirasoli M，Simoni P，et al. Development and validation of an ultrasensitive chemiluminescent enzyme immunoassay for Afatoxin M in milk[J].J Agric Food Chem，2005，53（9）：3300-3305.

[8] Zhao L X，Lin J M，Li Z，et al. Development of a highly sensitive，second antibody format chemiluminescence enzyme immunoassay for the determination of 17β-estradiol in waste water[J]. Anal Chim Acta，2006，558（1）：290-295.

Development of Chemiluminescent Immunoassay（CLIA）Kit for Ractopamine

Shen Haolong1，Chen Qiaoqin1，Zhang Changgong1，He Qiong1，Zhang Hui1，Xu Jingbo1，Guo Shulin2，Huang Yinyao2

（1.Xiamen Bushing Biology Co Ltd.，Xiamen，Fujian 321026；2. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，Fujian 321026）

A direct competition immunoassay was established for detection of ractopamine（RAC） by preparing highly active monoclonal antibody to RAC labeled with HRP and using luminol as chemiluminescent substrate. And a chemiluminescent immunoassay was successfully developed after optimizing the parameters including coating buffer，coating conditions，coating protein concentration，blocking protein type，incubation time，enzyme consumption. The linear range was 0.1-10 ng/mL，the linear correlation coeffcient was r=0.998，the TC50was 0.6763 ng/mL，the detection limit was below 0.1 ng/mL，the within-run coeffcient of variation was 7.62%-8.65%，the between-run coeff cient of variation was 8.15%，the recovery rate was between 85±15%，and there was no cross reaction with otherβagonists by using this method.

Ractopamine（RAC）；chemiluminescent immunoassay（CLIA）；kit

TS207.53

A 文章編號：1005-944X（2014）07-0091-06

沈浩龍