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（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530001）

奶牛乳房炎3種主要致病菌三重PCR檢測(cè)方法的建立

陳亞明，杜玉蘭，聶培，任怡靜，賀婷，杜向宏，楊蓉，左宗輝，何寶祥

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530001）

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌是引起奶牛乳房炎的三種常見(jiàn)致病菌，本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因、大腸桿菌的16S-23SrRNA基因和蠟樣芽孢桿菌的hblA基因，設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物，通過(guò)單純PCR 和多重PCR體系和條件優(yōu)化，建立奶牛乳房炎主要致病菌三重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)50 份臨床乳房炎乳樣分別用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法和三重PCR方法進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)。結(jié)果：建立的三重PCR 方法能對(duì)同一樣品中的3種病原菌以及與沙門氏菌等其他6種細(xì)菌的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)靈敏度分別為0.1pg/uL、0.01pg/uL、0.1pg/uL。該P(yáng)CR方法對(duì)50份臨床乳房炎乳樣檢測(cè)結(jié)果，表面該方法的檢出率比傳統(tǒng)培養(yǎng)法的高。

質(zhì)奶牛； 乳房炎；PCR；診斷；致病菌

奶牛乳房炎是危害世界奶牛業(yè)的主要疾病之一，它不僅影響產(chǎn)奶量，而且影響牛奶品質(zhì)，危害人類健康，造成奶牛場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失。病原微生物感染是引起奶牛乳房炎的主要原因，病原微生物很多，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎的3種重要致病菌[1-2]。傳統(tǒng)的病原菌分離鑒定耗時(shí)較長(zhǎng)，且方法繁瑣，因此需要?jiǎng)?chuàng)建更加準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法，對(duì)奶牛乳房炎，尤其是隱性乳房炎的診斷與防治具有重要意義[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多重PCR體系的建立，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)奶牛乳房炎3種重要致病菌的快速檢測(cè)，為奶牛乳房炎的快速診斷提供參考。

1 材料

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC33591、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC44102、蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14579 ，對(duì)照用的沙門氏菌、白色念珠菌，肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 主要儀器

手提式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自Motic；電子天平購(gòu)自島津；微量移液槍購(gòu)自Eppendorf；-80℃超低溫冰箱購(gòu)自海爾集團(tuán)；離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 主要試劑

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌生化微量鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉微生物顯色培養(yǎng)基公司；革蘭氏染色液購(gòu)自濰坊漢唐生物工程有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)和模板制備

分別挑取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌三株標(biāo)準(zhǔn)菌單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取2mL菌液，12000 r/min離心10min，收集沉淀的細(xì)菌-20℃保存?zhèn)溆没虺樘酓NA用。

2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因、蠟樣芽孢桿菌的hblA 基因、大腸桿菌的16S-23SrRNA基因序列，利用Primer 510軟件設(shè)計(jì)各細(xì)菌特異性PCR引物（表1）。

表 1 引物的核苷酸序列

2.3 單一PCR體系的優(yōu)化

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌三株標(biāo)準(zhǔn)菌DNA模板，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)。經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系為：2.5μL的10×PCR buffer，2μL的1.5mmol/ L MgCl2，0.5μL的10mmol/L dNTPs，各引物50μmol/L 0.5μL，0.5μL的Taq酶（5U），1μL模板，加ddH2O至25μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4min；95℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。溫育15℃90min。

2.4 多重PCR體系的建立及優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)體系：2.5μL的10×PCR buffer、2μL的10mmol/LdNTPs、1.5μL的10mmol/ L MgCl2、0.5μL的Taq酶5U、DNA模板各1μL，加入50pmol/μL的金黃色葡萄球菌上、下游引物各0.1μL，50pmol/μL的大腸桿菌上、下游各0.3μL，50pmol/μL的蠟樣芽孢桿菌上、下游引物各0.5μL，加ddH2O13.7μL至25μL；擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56.8℃退火1min，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

2.5 特異性及靈敏性檢測(cè)

2.5.1 特異性試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和對(duì)照用的沙門氏菌、白色念珠菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、綠膿桿菌DNA作為模板， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.5.2 靈敏度試驗(yàn) 將已測(cè)定濃度的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌的模板DNA按100～10-5梯度進(jìn)行稀釋后分別混合，在優(yōu)化的多重PCR體系下進(jìn)行擴(kuò)增，觀察單一PCR和多重PCR擴(kuò)增的靈敏度。

2.6 三重PCR臨床檢測(cè)

采用該試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的多重PCR方法對(duì)50份患乳房炎的奶樣進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)參照國(guó)標(biāo)法對(duì)比，以驗(yàn)證建立的多重PCR檢測(cè)方法的可行性與準(zhǔn)確性。

2.7 瓊脂糖電泳分析

用2.0% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳時(shí)間40min，電壓為100 V。然后用EB替代進(jìn)行染色，觀察并分析出現(xiàn)的特異性條帶，保存結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR產(chǎn)物結(jié)果在Gen-Bank的BLAST中進(jìn)行序列比對(duì)，各特異性基因片段序列與金黃色葡萄球菌同源性達(dá)100%，與大腸桿菌同源性為99%，與蠟樣芽孢桿菌同源性為99%。

3.2 引物特異性檢測(cè) 根據(jù)3種致病菌的特異性引物與其他對(duì)照菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及蠟樣芽孢桿菌均可以擴(kuò)增出特定大小的條帶，其他對(duì)照菌株均呈陰性（圖1）。

3.3 PCR 敏感性檢測(cè)

將提取的DNA稀釋為10ng/μL，以此濃度的DNA為模板，逐次10倍梯度稀釋后進(jìn)行單重PCR以及多重PCR敏感性實(shí)驗(yàn)，觀察擴(kuò)增敏感性（圖2）。

3.4 奶樣品檢測(cè)

對(duì)送檢的50份奶牛乳房炎奶樣進(jìn)行三重PCR檢測(cè)，檢測(cè)出陽(yáng)性奶樣16份，而細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)出的陽(yáng)性奶樣為12份（表2）。三重PCR檢測(cè)方法與細(xì)菌分離鑒定方法對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的檢出符合率均為92%（表3），且PCR方法檢出率明顯高于細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法。

4 討論

圖1 引物特異性檢測(cè)結(jié)果

圖2 單重和多重PCR敏感性試驗(yàn)

表 2 用培養(yǎng)法和多重PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

表 3 三重PCR檢測(cè)方法的敏感性和符合率

本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)乳房炎3種主要病原的三重PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)臨床乳樣中的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌3種奶牛乳房炎主要致病菌進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明3重PCR的特異性好，在被檢的3種菌間以及與沙門氏菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌、沙雷氏菌、綠膿桿菌之間均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。對(duì)臨床樣品的檢測(cè)與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定相比較，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，且檢出率高[6-8]。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可知，金黃色葡萄球菌單重PCR擴(kuò)增的敏感性可達(dá)0.1pg/μL（圖2A）。大腸桿菌單重PCR擴(kuò)增的敏感性可達(dá)0.01pg/μL（圖2B）。蠟樣芽孢桿菌單重PCR擴(kuò)增的敏感性可達(dá)0.1pg/μL（圖2C）。運(yùn)用已優(yōu)化的反應(yīng)體系及程序進(jìn)行三重PCR敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明三重PCR對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌的最低同時(shí)檢出量為10pg/μL（圖2D），說(shuō)明了多重PCR的敏感性比單重PCR的敏感性低。這可能是由于多重PCR引物間相互作用或多對(duì)引物間形成了二聚體，影響了引物與模板DNA的有效結(jié)合，因而使得多重PCR擴(kuò)增效率下降，敏感度降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也符合上述結(jié)論，即本實(shí)驗(yàn)中三重PCR敏感性〈二重PCR敏感性〈單重PCR敏感性，因此設(shè)計(jì)多重PCR反應(yīng)體系，引物間的兼容性至關(guān)重要，引物-引物和引物-模板間相互作用會(huì)直接降低PCR反應(yīng)的敏感度，因此尋求兼容性最好的引物對(duì)是提高多重PCR反應(yīng)效率和監(jiān)測(cè)敏感性的最中要的問(wèn)題。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌引起高產(chǎn)奶牛的乳房炎較多，臨床獸醫(yī)很難確診其病原，應(yīng)用本研究建立的三重PCR檢測(cè)方法，可以進(jìn)行臨床診斷。此外，這3種病原引發(fā)的乳房炎，病初的癥狀不明顯，常表現(xiàn)為隱性乳房炎[9-10]，不易被人們發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)所建立的3重PCR檢測(cè)方法可以快捷準(zhǔn)確檢測(cè)出金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌引起的早期奶牛隱性乳房炎，這對(duì)奶牛乳房炎早期進(jìn)行監(jiān)控具有臨床意義[11-12]。

[1] 馬保臣，秦卓明，蔡玉梅，等. 多重PCR檢測(cè)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和酵母菌方法的建立與應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（11）：1202-1208.

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Development of a Triplex PCR Assay for Detection of Three Major Bovine Mastitis Pathogens

Chen Yaming，Du Yulan，Nie Pei，Ren Yijing，He Ting，Du Xianghong，Yang Rong，Zuo Zonghui，He Baoxiang

（College of Animal Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005）

Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus cereus are three common pathogens dairy cow mastitis. Three pairs of specifc oligonucleotide primers were designed according to the DNA sequences of gene nuc in Staphylococcus aureus，gene 16S-23SrRNA in Escherichia coli and gene hb1A in Bacillus cereus，and a triplex polymerase chain reaction（PCR）assay was developed by improving the systems and procedures of three single PCRs and multiplex PCR. The triplex PCR and traditional bacterial cultivation were evaluated by examining 50 clinical mastitis milk samples. The result showed no cross reaction was detected by the triplex PCR among these 3 bacteria and the other common bacteria. The sensitivity of triplex PCR to Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus cereus was 0.1pg/uL、0.01pg/uL and 0.1pg/ uL respectively. The results showed that mutiplex PCR was more sensitive than culture method.

Dairy cows；Mastitis；PCR；Diagnosis；Pathogens

S855.1

A 文章編號(hào)：1005-944X（2014）07-0082-04

教改項(xiàng)目“廣西高等學(xué)校動(dòng)物醫(yī)學(xué)優(yōu)勢(shì)專業(yè)及課程一體化建設(shè)”（編號(hào)：GXTSZY141），國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：31260631）

何寶祥