陳茜茜，黃 明，周光宏，徐幸蓮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

動(dòng)物的肌肉組織在屠宰后的成熟過程中會(huì)發(fā)生結(jié)締組織松散、Z線降解和肌原纖維蛋白及細(xì)胞骨架蛋白水解等變化，使肌肉的僵直解除、持水力加強(qiáng)、嫩度提高，從而很大程度改善了肉的食用品質(zhì)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌中內(nèi)源酶與肉類的成熟嫩化過程聯(lián)系密切，主要包括鈣激活酶體系、溶酶體組織蛋白酶類和細(xì)胞凋亡酶體系[2-3]。其中鈣激活酶在肉類宰后成熟過程中的重要作用已被大量的研究報(bào)道所證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)用鈣激活酶在體外孵育肌原纖維蛋白能完全模擬自然成熟條件下伴肌動(dòng)蛋白、伴肌球蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T等蛋白的降解情況[4]。向雞肉中注射鈣激活酶抑制劑后，部分關(guān)鍵肌原纖維蛋白的降解顯著降低，雞肉的嫩度變差[5]。成熟過程中不同物種之間的嫩化程度差異與鈣激活酶抑制蛋白和鈣激活酶的表達(dá)量之比之間也被證實(shí)存在負(fù)相關(guān)性[6]。在肉類的宰后成熟過程中，鈣激活酶對(duì)部分關(guān)鍵肌原纖維蛋白如伴肌球蛋白、伴肌動(dòng)蛋白、肌間線蛋白及肌鈣蛋白-T等的降解作用改善了肉的嫩度、風(fēng)味、持水力等品質(zhì)[7]。由此可知，鈣激活酶在肉類成熟機(jī)制中起著極為重要的作用[8]。

肌肉組織中富含亞鐵血紅素、不飽和脂肪酸、金屬催化劑等促氧化因子，因此在肉類宰后成熟、加工、運(yùn)輸及貯藏過程中，肌肉組織極易被氧自由基攻擊?，F(xiàn)有研究均集中于肌肉組織中的脂肪和蛋白質(zhì)氧化對(duì)肉的食用品質(zhì)如肉色、嫩度、持水力、風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響。如脂肪氧化會(huì)造成紅肉的肉色褪色和酸敗，形成不良風(fēng)味[9]；而添加一些抗氧化劑如VC、VE則可以抑制蛋白質(zhì)氧化而使肉色保持鮮紅[10]；經(jīng)過輻照處理的牛肉在宰后成熟過程中剪切力明顯高于對(duì)照組，即嫩度降低[11]；純化的肌原纖維蛋白在體外被H2O2氧化后持水力降低[12]；賴氨酸、精氨酸等必需氨基酸的結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)氧化過程中會(huì)被不可逆轉(zhuǎn)的修飾，因此肉類蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也相應(yīng)降低[13]。

但是，氧化引起這些品質(zhì)變化的具體機(jī)制尚未被明確闡述，仍需要深入的研究。大部分研究主要圍繞氧化對(duì)肌原纖維蛋白降解的影響。有研究將純化的肌原纖維蛋白和純化 -鈣激活酶氧化后，再分別與 -鈣激活酶和肌原纖維蛋白孵育，結(jié)果顯示與嫩度密切相關(guān)的鈣激活酶-T的降解均被抑制[14-15]。鈣激活酶是一類半胱氨酸蛋白酶，其活性位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基是各類氨基酸中最易被氧化的[13,16]，且與羥基自由基的反應(yīng)活性較強(qiáng)[17]。據(jù)此推斷氧化是通過改變鈣激活酶的中心活性基團(tuán)進(jìn)而改變其對(duì)肌原纖維蛋白的降解作用，然而這方面的報(bào)道較少，因此研究氧化對(duì)鈣激活酶結(jié)構(gòu)和活性的影響十分必要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛肉體外注射氧化劑，通過活性電泳(casein zymography)和蛋白免疫印跡（Western blotting）研究鈣激活酶在牛肉自然成熟過程中的活性及降解變化，旨在闡明氧化條件下的鈣激活酶和關(guān)鍵肌原纖維蛋白之間的作用機(jī)制，為全面闡述氧化對(duì)肉類成熟的影響機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，并為實(shí)際生產(chǎn)過程中肉類品質(zhì)的改善提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取3頭年齡約2.5歲、活體質(zhì)量約500 kg、宰后20 min內(nèi)的魯西黃牛背最長(zhǎng)肌，牛來源于安徽翰森荷金來屠宰場(chǎng)。

Clone 9A4H8D3鼠單克隆抗μ-鈣激活酶 美國Abcam公司；過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白 美國Bio-Rad公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜 美國Millipore公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒和酶放大化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）試劑盒 美國Thermo公司：牛血清白蛋白 美國Promega 公司；酪蛋白 美國Sigma公司；FeSO4、H2O2、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、TritonX-100均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U410型超低溫冰柜 日本日立公司；Spectramax M2酶標(biāo)儀 美國MD公司；AUY120型電子分析天平日本Shimadzu公司；Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國Basis公司；HANNA 211 型pH計(jì) 意大利Hanna公司；Beckman冷凍離心機(jī) 美國Avanti J-E公司；小型垂直電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

取3條背最長(zhǎng)肌作為3組平行，每條背最長(zhǎng)肌切出20塊，并將這20塊隨機(jī)平均分為4組，分別注射4個(gè)濃度的氧化劑：0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O1組）、50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O2組）、200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O3組）、500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O4組）。注射量為肉質(zhì)量的5%。隨后立即真空包裝。另外兩條背最長(zhǎng)肌作相同處理。將樣品置于4 ℃存放0、1、3、7、14 d后取樣，每個(gè)處理均取3個(gè)樣。

1.3.1 鈣激活酶提取與電泳樣品制備

參照Camou等[18]的方法，取1 g已剔除結(jié)締組織的肉樣，加入3倍體積的提取液（100mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、體積分?jǐn)?shù)0.05%β-巰基乙醇，pH 8.3）。使用高速勻漿機(jī)在4 ℃、15 000 r/min條件下勻漿30 s，每隔10 s間隔10 s。然后在20 000×g、4 ℃條件下離心30 min。取上清液，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度并統(tǒng)一調(diào)整。

活性電泳樣品制定：按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（150 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、0.75%β-巰基乙醇、0.02%溴酚藍(lán)，pH 6.8），隨即放入-80 ℃冰箱備用。

SDS-PAGE電泳樣品制定：按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（30 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3%SDS、20%甘油、8%巰基乙醇、0.04%溴酚藍(lán)，pH 8.0），50 ℃水浴20 min，隨即放入-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 活性電泳[19]測(cè)定鈣激活酶活性

本實(shí)驗(yàn)中使用0.75 mm的膠板，12.5%的分離膠（1.5 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL四甲基乙二胺（TEMED），2.1 mg/mL酪蛋白）和4%的濃縮膠（125 mmol/L T r i s-H C l、p H 6.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mLTEMED）。恒壓100 V預(yù)跑15 min后上樣40 μg蛋白，繼續(xù)跑5 h。電泳完成后，用孵育液洗膠3次，每次20 min，隨后將膠放入孵育液室溫下反應(yīng)16 h。考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1 h，脫色過夜后用GelDox凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.3 蛋白免疫印跡法[20]分析鈣激活酶的降解

采用1.0 mm的膠板，10%的分離膠（1.5 mol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL SDS，0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL TEMED）和4%的濃縮膠（0.5mol/L Tris-HCl、pH 6.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL的SDS，0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL TEMED進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為40 μ g，恒壓80 V跑20 min后，恒壓120 V繼續(xù)跑90 min。電泳結(jié)束后，采用濕法轉(zhuǎn)印，將凝膠置于轉(zhuǎn)印液（20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、15%甲醇）中恒流200 mA轉(zhuǎn)印90 min，待蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TTBS溶液（500 mmol/L NaCl、30 mmol/L Tris-HCl、0.05%吐溫-20，pH 7.5）中于室溫封閉2 h。然后將膜與1∶500稀釋的鼠單克隆抗μ-鈣激活酶在4 ℃條件下反應(yīng)過夜后，用Tris-吐溫鹽緩沖液（全稱，TTBS）漂洗4次，每次10 min。再與按1∶5 000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白溶液室溫反應(yīng)2h，繼續(xù)用TTBS漂洗4次。最后用ECL法顯色。

1.3.4 μ-鈣激活酶的半定量分析

采用Quanity-One分析軟件對(duì)蛋白免疫印跡條帶光密度值進(jìn)行半定量；μ-鈣激活酶免疫印跡條帶相對(duì)光密度值分別為目標(biāo)條帶光密度值與宰后0 d未氧化處理組蛋白條帶光密度值的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每組樣品做3組平行，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，不同氧化處理組和不同成熟時(shí)間之間的差異使用鄧肯多重比較，P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外氧化對(duì)牛肉自然成熟過程中鈣激活酶活性的影響

通過活性電泳分析在氧化條件下牛肉宰后成熟過程中鈣激活酶的活性變化（圖1），并對(duì)μ-鈣激活酶的活性條帶進(jìn)行半定量，得到其相對(duì)光密度值（圖2）。宰后0 d和1 d時(shí)，氧化對(duì)μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶的活性幾乎沒有影響，各氧化組的相對(duì)光密度值均無顯著差異（P＞0.05）。成熟3 d時(shí)，μ-鈣激活酶活性較0 d時(shí)有所降低，此時(shí)高氧化組的μ-鈣激活酶活性條帶的相對(duì)光密度值為68.38%，較未氧化組有顯著差異（P＜0.05）。7 d以后，活性電泳圖顯示，隨著氧化劑濃度的提高，μ-鈣激活酶活性受到抑制。當(dāng)氧化劑濃度為50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時(shí)，μ-鈣激活酶活性與未氧化組相比受到輕微抑制，而當(dāng)氧化劑濃度為500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時(shí)，μ-鈣激活酶活性被顯著抑制，此時(shí)m-鈣激活酶活性條帶與0、1、3 d相比幾乎沒有變化。牛肉宰后成熟14 d后，活性電泳僅能檢測(cè)到μ-鈣激活酶的微弱活性，且μ-鈣激活酶活性隨著氧化劑濃度的提高而越來越弱，高氧化組的μ-鈣激活酶活性條帶的相對(duì)光密度值僅為5.97%，與其他各組相比均有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果顯示氧化能夠抑制牛肉宰后成熟過程中μ-鈣激活酶的活性，這與Carlin等[21]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH值范圍為6.0～7.5，離子強(qiáng)度分別為165 mmol/L和295 mmol/L時(shí)，H2O2的加入能顯著抑制豬肉中μ-鈣激活酶的活性。同時(shí)，隨著牛肉宰后成熟時(shí)間的增長(zhǎng)，未氧化組的鈣激活酶活性逐漸降低，尤其成熟14 d后的活性條帶非常微弱（圖1），因此宰后儲(chǔ)藏時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)對(duì)鈣激活酶活性產(chǎn)生較大影響。

圖2 不同氧化水平對(duì)牛肉宰后成熟過程中 -鈣激活酶活性條帶的相對(duì)光密度值的影響Fig.2 Relative optical density of μ-calpain activity under various oxidative conditions during beef postmortem ageing

圖1 不同氧化水平對(duì)牛肉宰后成熟過程中μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶活性影響的活性電泳分析Fig.1 Casein zymography analysis showing the effect of variable oxidative conditions on the activity of μ-calpain and m-calpain during beef postmortem ageing

另外活性電泳結(jié)果顯示，牛肉宰后成熟14 d時(shí)，當(dāng)氧化劑濃度為0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時(shí)，出現(xiàn)了m-鈣激活酶降解片段的活性條帶，而氧化劑濃度升高后，此條帶消失，因此可以推測(cè)氧化抑制了m-鈣激活酶的降解。這與Rowe等[22]的研究結(jié)果類似，他們發(fā)現(xiàn)在其自然成熟過程中輻照組的m-鈣激活酶降解片段的活性條帶消失。

2.2 體外氧化對(duì)牛肉自然成熟中鈣激活酶降解的影響

圖3 不同氧化水平對(duì)牛肉宰后成熟過程中80 kD μ-鈣激活酶降解影響的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis showing the effect of various oxidative conditions on μ-calpain autolysis during beef postmortem ageing

本實(shí)驗(yàn)中使用的鼠單克隆抗μ-鈣激活酶能夠特異性識(shí)別80 kD的μ-鈣激活酶片段，通過蛋白免疫印跡法分析μ-鈣激活酶降解情況（圖2）；采用QuatityOne分析軟件對(duì)蛋白印跡條帶光密度值進(jìn)行半定量，得到不同成熟時(shí)間各氧化組μ-鈣激活酶的相對(duì)光密度值（表1）。μ-鈣激活酶的Western-blotting結(jié)果（圖3）顯示牛肉在宰后0 d和1 d時(shí)，幾乎沒有發(fā)生降解；在宰后成熟3 d后，分子質(zhì)量為80kD的μ-鈣激活酶條帶變淺，此時(shí)經(jīng)高濃度氧化劑處理的μ-鈣激活酶的相對(duì)光密度值為76.42%。7 d以后，μ-鈣激活酶免疫印跡條帶隨氧化濃度升高而逐漸變淺，不同氧化處理組的相對(duì)光密度值分別為52.28%、49.64%、44.21%、37.56%；宰后成熟14 d時(shí)，μ-鈣激活酶發(fā)生了更大程度的降解，各組相對(duì)光密度值分別達(dá)到30.08%、27.73%、20.11%、9.75%，即當(dāng)氧化劑濃度為200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時(shí)，μ-鈣激活酶降解與未氧化組相比差異顯著（P＜0.05，表1）。以上結(jié)果表明當(dāng)宰后自然成熟的時(shí)間相同時(shí)，經(jīng)高濃度氧化劑處理的牛肉的 -鈣激活酶的相對(duì)光密度值均顯著高于未氧化處理組，因此高濃度氧化劑在牛肉的宰后成熟過程可以顯著促進(jìn)μ-鈣激活酶的降解。而 -鈣激活酶的降解在牛肉的宰后成熟過程中持續(xù)進(jìn)行，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而加強(qiáng)，表1顯示牛肉在自然成熟0、1、3、7、14 d時(shí)，相同氧化處理組之間的μ-鈣激活酶相對(duì)光密度值均有顯著性差異，這說明貯藏時(shí)間對(duì)鈣激活酶的影響大于氧化對(duì)其的影響。

結(jié)合活性電泳結(jié)果可知，μ-鈣激活酶的活性隨著其降解程度的增強(qiáng)而降低。曾有研究結(jié)果表明牛肉骨骼肌中μ-鈣激活酶的活性增強(qiáng)，同時(shí)其降解被抑制[11]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。μ-鈣激活酶的80 kD亞基包括蛋白酶活性結(jié)構(gòu)域和鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，μ-鈣激活酶一旦發(fā)生降解，活性結(jié)構(gòu)域便會(huì)被破壞，從而影響其活性。μ-鈣激活酶的激活所需的Ca2+濃度與自動(dòng)降解所需濃度接近，因此μ-鈣激活酶由80 kD向更小亞基如78 kD和76 kD的自動(dòng)降解為一直以來被認(rèn)為是μ-鈣激活酶激活的標(biāo)志，而μ-鈣激活酶被激活后的持續(xù)迅速降解導(dǎo)致了其活性的降低[23]。

表1 不同氧化水平對(duì)牛肉宰后成熟過程中 -鈣激活酶相對(duì)光密度值的影響Table 1 Relative optical density of -calpain under various oxidative conditions during beef postmortem ageing %

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在牛肉的宰后成熟過程中，氧化能促進(jìn)80 kD的μ-鈣激活酶降解并抑制其活性，當(dāng)氧化劑濃度為500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時(shí)，μ-鈣激活酶的活性和降解較未氧化組均有顯著差異；并且當(dāng)牛肉宰后成熟7 d以后，氧化對(duì)鈣激活酶的影響較成熟1、3 d相比影響更大。這說明在肉類宰后成熟及貯藏過程中，輻照、冷凍解凍、高氧包裝等因素導(dǎo)致的氧化反應(yīng)會(huì)促進(jìn)μ-鈣激活酶降解并抑制其活性。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還揭示了牛肉的宰后儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)鈣激活酶降解及活性影響大于注射氧化劑對(duì)其的影響。μ-鈣激活酶作為肉類宰后嫩度改善的主要貢獻(xiàn)者，它的活性變化必然對(duì)肉類宰后相關(guān)食用品質(zhì)如嫩度、風(fēng)味等產(chǎn)生不利影響。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為肉類宰后成熟過程中食用品質(zhì)的改善提供了科學(xué)依據(jù)。

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