王孝研，李妍，柳羽豐

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江哈爾濱150050）

四種乳酸菌組合在豆乳飲料中的發(fā)酵研究

王孝研，李妍，柳羽豐

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江哈爾濱150050）

采用干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌4種乳酸菌純種發(fā)酵與不同的菌種組合在豆乳飲料中的發(fā)酵的研究，并通過pH值、酸度值和感官品質(zhì)確定適宜的乳酸菌混種發(fā)酵配比。結(jié)果表明干酪乳桿菌分別與瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌組合在純豆乳飲料生長產(chǎn)酸能力相當(dāng)；應(yīng)用干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌，配比依次為6∶1.5∶1∶1時，較其他組合有明顯提高。發(fā)酵生成的大豆酸乳酸度適宜、發(fā)酵速度最快、酸乳飲料組織形態(tài)均勻、香味豐富柔和。

大豆；發(fā)酵豆乳飲料；乳酸菌；豆乳飲料

發(fā)酵豆乳飲料具有獨特的風(fēng)味，酸甜適度，芳香可口，營養(yǎng)豐富，含有多種對人體有益的乳酸菌，因而深受廣大消費者的青睞。豆乳飲料經(jīng)發(fā)酵后既能發(fā)揮大豆的營養(yǎng)功能，又能消除豆乳飲料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[1]，使大豆蛋白質(zhì)的消化率得到明顯提高，是一種集大豆?fàn)I養(yǎng)與乳酸菌功效于一體的新型保健產(chǎn)品。傳統(tǒng)發(fā)酵乳中常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對胃酸和膽汁非常敏感，難以到達(dá)腸道[2]。而嗜酸乳桿菌耐酸和膽鹽的能力較強(qiáng)，能在腸道內(nèi)定殖。同時具有優(yōu)良的保健功能，因此，更符合人們對健康的需求。而以豆乳飲料為原料加工發(fā)酵乳，成本更為低廉，且豆乳飲料中含有促進(jìn)益生菌生長的增殖因子，能夠一定程度上縮短發(fā)酵時間，克服嗜酸乳桿菌在發(fā)酵乳中生長較差的缺點[3]。

選擇適宜發(fā)酵豆乳飲料的菌種，國內(nèi)對大豆酸奶的研究所用的乳酸菌主要是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，也有部分人加入了雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌等益生菌研究發(fā)酵大豆酸奶的，但是總的來看，用益生菌發(fā)酵大豆酸奶的研究比較少，而且研究也不夠深入。發(fā)酵豆乳飲料的制備通常按照發(fā)酵純牛乳的工藝，通過改變菌種及發(fā)酵條件等進(jìn)行改進(jìn)。

1 實驗部分

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大豆、鮮牛乳，市售，產(chǎn)地黑龍江。

脫脂乳粉（蛋白質(zhì)含量36.4%），產(chǎn)自新西蘭。酚酞、乙醇、NaOH，均為分析純。

1.1.2 菌種

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus LH-B02，簡寫為LH-B02）：丹麥漢森（Hansen’s公司）；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，簡寫為L.casei)（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室）；嗜酸乳桿菌（L. acidophilus，簡寫為L.a）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室）；保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus，簡寫為L.b）（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實驗室）。

1.1.3 培養(yǎng)基菌株保存與傳代培養(yǎng)基為：12%脫脂乳經(jīng)115℃滅菌10min，冷卻至40℃后接種，接種量為10%，于37℃培養(yǎng)12～24h，凝乳后置4℃冰箱中保存。

鑒定及計數(shù)培養(yǎng)基為：MRS瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋責(zé)任有限公司）；MC瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋責(zé)任有限公司）；TPY瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋責(zé)任有限公司）。

1.1.4 儀器與設(shè)備DJ12B-A11D豆?jié){機(jī)（九陽股份有限公司）；SW-CJ-1FD型無菌操作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；YXQ-SG46-280S型手提式高壓滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；增力電動攪拌器（江蘇省金壇市金城國盛儀器有限公司）；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；TDZ4臺式自動平衡離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；PHS-3C精密pH計（上海市雷磁儀器廠）；電子分析天平（北京市儀器二廠）；微量取液器（北京青云航空儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；電熱干燥箱（天津泰斯特責(zé)任有限公司）。

1.2 實驗方法

采用干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌4種菌株，利用豆乳飲料最適發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵。分別采用單菌種發(fā)酵、多菌種發(fā)酵兩種方式，測定乳酸菌發(fā)酵豆乳飲料的pH值及酸度并進(jìn)行感官評價。確定一株主發(fā)酵菌株后與其他3株乳酸菌組合，進(jìn)行多菌種發(fā)酵，并確定該方式的最適菌種配比，進(jìn)行后續(xù)實驗。設(shè)置3個平行，混勻后42℃靜止培養(yǎng)5～6h后取出，4℃后熟24h。

1.2.1 酸度的測定以乳酸（%）為酸度測定指標(biāo)進(jìn)行測定分析。吸取10mL發(fā)酵豆乳飲料置于250mL三角瓶中，加入40mL新沸放冷的蒸餾水，再加入0.5 mL0.5%酚酞乙醇溶液，振蕩混勻，用0.1mol·L-1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30s不褪色即為終點，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL），乘以10即得發(fā)酵豆乳飲料的酸度（0T）。如果NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度不為0.1mol·L-1，則需要進(jìn)行濃度換算。

酸度=[V1（NaOH）-V0（NaOH）]×10

式中V1（NaOH）：滴定至終點后NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積讀數(shù)，mL；V0（NaOH）：滴定起點處NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積讀數(shù)，m L。

1.2.2 pH值的測定將發(fā)酵好的豆乳飲料從4℃冰箱中取出，振蕩混勻后，用pH計測定樣品的pH值，按QB/T 1803執(zhí)行。

1.2.3 發(fā)酵豆乳飲料的感官評價與描述選取15名接受過專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)的感官評價員，感官要求，以色澤、氣味、口感和組織形態(tài)為指標(biāo)對最適發(fā)酵工藝獲得的乳酸菌發(fā)酵豆乳飲料進(jìn)行感官評價。各項評價內(nèi)容分別以兩個感官性狀描述詞代表兩個極端（表1中第2、4兩行），由感官評價員給予打分。各項總計100分，相應(yīng)等級包括：100～85分為“好”，85～60分為“一般”，<60分為“差”。具體評價內(nèi)容見表1。

表1 發(fā)酵豆乳飲料感官評價表Tab.1 Item and index in sense evaluation of lactobacillus fermented soy yogurt by soybeans.

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌種發(fā)酵

分別采用瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌4種益生菌進(jìn)行單菌種發(fā)酵，為考察豆乳飲料中各菌生長產(chǎn)酸情況，將各菌分別接種于純豆乳飲料、純牛乳與混合豆乳飲料中，感官評價發(fā)現(xiàn)以混合豆乳飲料為原料，經(jīng)各菌株單菌種發(fā)酵感官品質(zhì)差異微小。pH值與酸度值比較結(jié)果見表2。

表2 單菌種發(fā)酵豆乳飲料的pH值和酸度值Tab.2 Effectof four single strines on the pH value and titratable acidity of soy-based yogurt

結(jié)果表明，瑞士乳桿菌在混合乳中產(chǎn)酸能力很強(qiáng)，但在純豆乳飲料中產(chǎn)酸能力不夠強(qiáng)，生長不夠好，干酪乳桿菌在純豆乳飲料中生長產(chǎn)酸能力比瑞士乳桿菌強(qiáng)，研究還得出，純種發(fā)酵中干酪乳桿菌發(fā)酵生成酸度最快，因此，以干酪乳桿菌為主發(fā)酵菌。

2.2 多菌種發(fā)酵

以干酪乳桿菌為主發(fā)酵菌，分別與瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌3種益生菌組合發(fā)酵，按表3所列比例進(jìn)行組合。

表3 多菌種組合編號與詳情（%）Tab.3 Combinition number and lactobacillus ofmultiple strines

將各組合菌種分別接種于2.2確定的發(fā)酵原料（混合豆乳飲料）中，進(jìn)行多菌種發(fā)酵，測定其pH值與酸度值，并進(jìn)行感官評價，結(jié)果分別見表4、5。

表4 乳酸菌多菌種發(fā)酵豆乳飲料的感官評價結(jié)果Tab.4 Comparison of sense evaluation of soy yogurtmade by four different single strines

結(jié)果表明，經(jīng)多菌株發(fā)酵，色澤與組織形態(tài)指標(biāo)未見明顯差別，口感指標(biāo)中組合1-1、1-2、2-1、2-2、2-3差異微小，組合1-3與3-1明顯優(yōu)于其他組合，但組合1-3氣味質(zhì)標(biāo)不如組合3-1。氣味指標(biāo)中組合1-1、1-2、1-3、2-1、2-2差異微小，組合2-3與3-1明顯優(yōu)于其他組合。感官評價總分組合2-3與3-1較高。

表5 多菌種發(fā)酵豆乳飲料的pH值和酸度值Tab.5 Effectofmutiple strines on the pH value and titratable acidity of soy-based Yogurt

結(jié)果表明，混種發(fā)酵較純種發(fā)酵大豆乳飲料酸度上升更快、香味更為豐富，干酪乳桿菌分別與瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌組合在豆乳飲料中生長產(chǎn)酸能力相當(dāng)；應(yīng)用干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌這一組合發(fā)酵劑（組合3-1）制備的產(chǎn)品在理化與感官指標(biāo)上均最佳。

2.3 菌種配比的優(yōu)化

針對4菌組合發(fā)酵，即干酪乳桿菌為主發(fā)酵菌、瑞士乳植菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌四菌組合發(fā)酵，設(shè)計三因素三水平正交實驗，以酸度值為指標(biāo)，對其配比進(jìn)行優(yōu)化實驗，正交實驗的因素水平與直觀分析見表6。

由表6正交實驗結(jié)果可知，干酪乳桿菌為主發(fā)酵菌、瑞士乳植菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌對發(fā)酵豆乳飲料的酸度值影響程度依次為：A>B>D>C，即干酪乳桿菌>瑞士乳植菌>嗜酸乳桿菌>保加利亞乳桿菌，其中，干酪乳桿菌與瑞士乳植菌的比例變化對發(fā)酵豆乳飲料酸度值影響程度接近，并明顯超過保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的影響程度。最佳菌種配比組合為A3B3C2D2，干酪乳桿菌、瑞士乳植菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌的菌種比例依次為：60%∶15%∶10%∶10%（6∶1.5∶1∶1）。

經(jīng)驗證實驗，4種乳酸菌配比依次為6∶1.5∶1∶1時，酸度值可達(dá)117.1 oT，較其他組合有明顯提高。發(fā)酵生成的大豆酸乳酸度適宜、發(fā)酵時間最短、酸乳飲料組織形態(tài)均勻、香味豐富柔和。應(yīng)用該比例進(jìn)行豆乳飲料發(fā)酵工藝的研究。

表6 正交實驗直觀分析表Tab.6 Orthogonal experimental design and analysis

3 結(jié)論

分別采用瑞士乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌4種益生菌進(jìn)行單菌種發(fā)酵，瑞士乳桿菌在混合乳中產(chǎn)酸能力很強(qiáng)，但在純豆乳飲料中產(chǎn)酸能力不夠強(qiáng)，生長不夠好，干酪乳桿菌在純豆乳飲料中生長產(chǎn)酸能力比瑞士乳桿菌強(qiáng)，研究還得出，純種發(fā)酵中干酪乳桿菌發(fā)酵生成酸度最快，這可能由于干酪乳桿菌中富含的酶類與大豆蛋白酶切位點相符合的程度高于其他3種乳酸菌，因此，對大豆蛋白的利用率較高，產(chǎn)酸速度較快。

干酪乳桿菌為主發(fā)酵菌、瑞士乳植菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌4菌組合發(fā)酵，較純種發(fā)酵大豆乳飲料酸度上升更快、香味更為豐富，制備的產(chǎn)品在理化與感官指標(biāo)上均最佳。分析原因是，在主發(fā)酵菌干酪乳桿菌決定了發(fā)酵豆乳飲料整體品質(zhì)的前提下，添加保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳植菌三菌，可以彌補干酪乳桿菌在利用大豆蛋白產(chǎn)香上的限制，起到增香和提高口感的效果。多菌種復(fù)合發(fā)酵，綜合了4種乳酸菌的益生作用與優(yōu)勢。

針對干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和瑞士乳桿菌3種乳酸菌純種發(fā)酵與不同的菌種組合在豆乳飲料中的發(fā)酵情況，確定最優(yōu)菌種配比為干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌依次為6∶1.5∶1∶1，發(fā)酵生成的大豆酸乳酸度適宜、發(fā)酵時間最短、酸乳飲料組織形態(tài)均勻、香味豐富柔和。

［1］Nakazawa Y.,Functions of fermentedmilks:Challenges for thehealth sciences［M］.London:ElsevierScience,1992.289-304.

［2］Paseephol T.,Small D.M.,Sherkat F.,Rheology and Texture of Set Yogurtas Affected by Inulin Addition［J］.Journal of Texture Studies,2008,39（6）:617-634.

［3］Potter，S.M.et al.Soybean protein concentrate and isolated soybean protein similarly lower blood serum cholesterolbutdifferently affect thyroid hormonesin hamster［J］.J.Nutr.1996，126（8）:2007-2011.

Study on ferm entation of four lactobacillus combination in soybean m ilk

WANG Xiao-yan,LIYan,LIU Yu-feng
（Academy of Quality Inspection and Research in Heilongjiang Province,Harbin 150050,China）

s：The fermentation of four lactobacillus of lactobacillus casei,lactobacillus acidophilus,Bulgarian lactobacillus and lactobacillus helveticus with different strains combination in the soybean milk were studied.The optimal proportioning for lactobacillus interbreeds of pH value,acid value and sensory qualities were determined. The results showed that growth abilities were equal of the combination of lactobacillus caseiwith lactobacillus acidophilus,Bulgarian lactobacillus and lactobacillus helveticus.The ratio of lactobacillus casei,lactobacillus helveticus and Bulgarian lactobacilluswith lactobacillus acidophilus were 6∶1.5∶1∶1,it showed better growth abilities.The lactococcuswere proper acid,fast fermentation rate,soft texture and rich flavor.

soy bean；soy yogurt；lactobacillus；soybeanmilk beverage

Q939.11

A

1002-1124（2014）07-0073-04

2014-05-10

王孝研（1981-），男，碩士研究生，工程師，主要從事食品和化工產(chǎn)品檢測。