李 杰，陸東明，吳 萍，王仁媛，張發(fā)斌，張廣梅，劉占厚，趙協(xié)慧，陳湘紅

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

中醫(yī)時(shí)間醫(yī)學(xué)內(nèi)容十分豐富，很多中醫(yī)經(jīng)典理論經(jīng)現(xiàn)代研究證實(shí)是有科學(xué)根據(jù)的。我們通過實(shí)驗(yàn)研究表明，太陽病(風(fēng)寒表證)“欲解時(shí)”與白介素存在著節(jié)律性變化，其對探討太陽病“欲解時(shí)”與人體免疫節(jié)律變化的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)和聯(lián)系、闡釋病情變化與人體內(nèi)在節(jié)律之間的關(guān)系都具有重要的意義，同時(shí)提供了增強(qiáng)擇時(shí)治療效果最佳時(shí)機(jī)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小鼠1152只，雌雄各半，體質(zhì)量19.6～22 g，購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心(蘭大動檢(08)第034號)。

1.1.2 試劑 小鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-10 ELISA定量檢測試劑盒96T，購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 RT-2100酶標(biāo)儀與洗板機(jī)(購自深圳雷杜公司)；TDL5M低速冷凍離心機(jī)；恒溫箱PY-2型。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 昆明種小鼠1152只，雌雄各半，體質(zhì)量19.6～22 g，置于恒溫20±2 ℃、相對濕度40±5%的環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按照雌雄各半隨機(jī)分為正常對照組576只、模型組576只。然后將各組動物按照雌雄各半再隨機(jī)分成16組，每組36只。模型組在文獻(xiàn)報(bào)道[1]“小鼠風(fēng)寒表證”模型制作方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)動物風(fēng)寒表證模型研究的成功經(jīng)驗(yàn)，每5～6只小鼠放置1個(gè)鼠籠，放置溫度2～5 ℃、濕度60%、風(fēng)力4～5級的自然光線環(huán)境中飼養(yǎng)7 d，小鼠自由活動攝食、飲水進(jìn)行動物造模。造模組普遍出現(xiàn)蜷臥或團(tuán)縮聚臥狀態(tài)、活動較少、弓背聳毛、打噴嚏、流涕、進(jìn)食明顯減少、飲水增多、肛溫升高、體質(zhì)量下降，即確認(rèn)模型復(fù)制成功。對照組不做任何處理，在18～21 ℃室溫環(huán)境中飼養(yǎng)7 d。

1.2.2 檢測方法 (1)血清制備：造模成功后連續(xù)7 d，從對照組和模型組隨機(jī)抽取2組動物，每天分別于11∶00-13∶00和23∶00-1∶00均以眼球取血法獲取造模組與對照組小鼠全血2 ml，其中1 ml在4 ℃條件下離心15 min(3000 r/min)制備血清，獲取造模成功后連續(xù)7 d時(shí)的小鼠血清標(biāo)本，并低溫保存?zhèn)溆靡孕懈髅庖咧笜?biāo)測定,另1 ml全血測定外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣與測定:根據(jù)試劑使用說明書的要求，分別配置小鼠IL-1、IL-2、IL-4、IL-10標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在板孔內(nèi)稀釋為不同濃度梯度，復(fù)孔制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。設(shè)空白和質(zhì)控復(fù)孔，樣品孔分別各加小鼠血清100 ul和生物素標(biāo)記抗體50 ul，37 ℃溫育90 min后分別洗滌5次。每孔再加入親和素-HRP標(biāo)記物50 ul，37 ℃溫育30 min后洗滌5次。然后分別加入TMB顯色劑，37 ℃溫育20 min后加終止液，酶標(biāo)儀450 nm分別測取OD值并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

2 結(jié)果

2.1 2組造模小鼠IL-1節(jié)律性變化

圖1顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、模型組IL-1存在晝低夜高的節(jié)律性變化；模型組IL-1表達(dá)與對照組節(jié)律基本平行一致，但在疾病期表達(dá)增強(qiáng)，尤以疾病第3～4天最為顯著。

2.2 2組造模小鼠IL-2節(jié)律性變化

圖2顯示，模型組和對照組IL-2的表達(dá)存在明顯的晝夜節(jié)律性，除了高峰外(第3天)表現(xiàn)為夜間高、白晝低的特點(diǎn)，2組IL-2的表達(dá)節(jié)律基本相一致；模型組IL-2的表達(dá)高于對照組，尤其模型組在發(fā)病初期(1～4 d)IL-2增高得更為明顯(P<0.01)，5 d后基本與對照組相一致。

2.3 2組造模小鼠IL-4節(jié)律性變化

圖3顯示，正常組小鼠體內(nèi)IL-4水平變化呈現(xiàn)出一定的節(jié)律性。首先是其表達(dá)白天低，夜間高，表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律性規(guī)律；其次連續(xù)7 d的觀察發(fā)現(xiàn)，其分泌量在欲解時(shí)初期逐步上升，3～4 d達(dá)到高峰，以后逐漸下降，表現(xiàn)出一定的周期節(jié)律性規(guī)律。模型組小鼠體內(nèi)IL-4水平變化與正常組呈現(xiàn)同步的節(jié)律性變化。

2.4 對照組與模型組造模小鼠IL-10節(jié)律性變化

圖4顯示，小鼠IL-10晝夜表達(dá)有不同；總體水平表現(xiàn)為對照組存在晝低夜高的自然節(jié)律變化(P<0.01)，模型組表達(dá)為晝高夜低的節(jié)律變化(P<0.01)。

圖1 2組1周內(nèi)IL-1含量變化情況

圖2 2組1周內(nèi)IL-2含量變化情況

圖3 2組1周內(nèi)IL-4含量變化的情況

圖4 2組1周內(nèi)IL-10含量變化情況

3 分析與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組與對照組小鼠外周血液中IL-1、IL-2、IL-4、IL-10的表達(dá)存在明顯的晝夜節(jié)律變化規(guī)律，其峰值在夜間陽氣極衰之時(shí)(23點(diǎn))，谷值在白天陽氣最盛之時(shí)(11點(diǎn))，其意義表現(xiàn)如下。

3.1 闡釋 “正氣”與人體物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)的內(nèi)在聯(lián)系

中醫(yī)學(xué)很早就認(rèn)識到人體原本就具有對抗疾病的自然免疫力，將之稱為正氣。它代表著人體對外界環(huán)境的適應(yīng)能力、抗病能力以及康復(fù)能力，這與免疫系統(tǒng)的防御、監(jiān)視、自穩(wěn)的三大功能相一致。從功能而言，免疫防御抵抗病原微生物的感染與中醫(yī)正氣衛(wèi)外功能；免疫自穩(wěn)、清除自身抗原、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境與正氣調(diào)節(jié)陰陽，維持“陰平陽秘”；免疫監(jiān)視與正氣協(xié)調(diào)臟腑經(jīng)絡(luò)氣血，免生積聚的作用是相似的，因此說人體正氣包含免疫系統(tǒng)物質(zhì)和功能概念。

太陽病“欲解時(shí)”為巳午未，此時(shí)為正午前后，白晝(11時(shí))自然界陽氣最旺，試驗(yàn)結(jié)果也顯示白介素含量表達(dá)最低，實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)免疫力最強(qiáng)，炎癥反應(yīng)最輕，正氣勝邪，鼓邪外出，病情減輕，病勢緩解，故太陽病欲解于晝時(shí)，其病變在晝夜中陽氣最隆盛時(shí)得自然界之陽氣和人體陽氣活動節(jié)律高峰時(shí)的資助而欲解，揭示了太陽病(風(fēng)寒表證)“欲解時(shí)”與人體免疫節(jié)律的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)和聯(lián)系。

3.2 揭示病情變化與人體內(nèi)在節(jié)律間關(guān)系

實(shí)驗(yàn)小鼠在白晝“欲解時(shí)”白介素含量表達(dá)最低，表現(xiàn)炎性反應(yīng)輕，與臨床患者的外感癥狀如鼻塞、流涕、頭痛、身痛等有所減輕一致。此為正氣驅(qū)邪外出、正勝于邪的表現(xiàn)；而與之相對的位置上為亥子丑，夜半前后陽氣入里潛藏，陰氣在外最盛，正不勝邪，太陽病(風(fēng)寒表證)的炎性反應(yīng)較重。再加之太陽經(jīng)病本來又多是表寒證，在陰氣的作用下必然會使病情進(jìn)展，病勢加重，在臨床相應(yīng)地表現(xiàn)為外感癥狀晝輕夜重。故《靈樞·順氣一日分為四時(shí)》指出：“夫百病者，多以旦慧、晝安、夕加、夜甚……朝則人氣始生，病氣衰，故旦慧；日中人氣長，長則勝邪，故安；夕則人氣始衰，邪氣始生，故加；夜半人氣入臟，邪氣獨(dú)居于身，故甚也?！薄叭藲狻睂儆谌梭w正氣的范疇，有人認(rèn)為“人氣”就是“陽氣”[2]，因?yàn)殛枤庥锌剐暗淖饔?，故臨床表現(xiàn)為旦慧、晝安、夕加、夜甚。由此可以看出，由太陽病(風(fēng)寒表證)“欲解時(shí)”與白介素夜高晝低的節(jié)律變化，可準(zhǔn)確判斷病情的輕重和病勢的發(fā)展。

3.3 提供增強(qiáng)擇時(shí)治療效果最佳時(shí)機(jī)的理論依據(jù)

疾病的“欲解時(shí)”非必解時(shí)，只說明疾病有解除的可能但非必愈。如果欲解，說明人體正氣較盛，邪不勝正，加上治療及時(shí)恰當(dāng)，再得天時(shí)的幫助，其病痊愈。故臨床上醫(yī)生當(dāng)借助天地陰陽之氣與人體陰陽之氣相應(yīng)之時(shí)，藥易以入，假天地陰陽之氣而行人身陰陽之氣御邪外出之功，確定逐時(shí)分治之法，因勢利導(dǎo)，使病易以解。時(shí)間藥理學(xué)的研究也證明，藥物作用的時(shí)間節(jié)律性是普遍存在的，這主要與機(jī)體生理功能的節(jié)律變化有關(guān)。由于機(jī)體的生物系統(tǒng)內(nèi)不斷發(fā)生節(jié)律性的變化，因而在不同的晝夜時(shí)相內(nèi)，機(jī)體在生物化學(xué)方面的反應(yīng)也不同。所以說，機(jī)體對不同時(shí)間所給予的相同刺激反應(yīng)不同；同一種藥物、同樣的劑量，在不同的時(shí)間內(nèi)對機(jī)體所起的作用也不同，這就是“藥物易感性節(jié)律”。鑒于這個(gè)觀點(diǎn)，通過我們的實(shí)驗(yàn)研究，臨床上應(yīng)用太陽病“欲解時(shí)”的理論擇時(shí)治療有以下兩方面的意義。

3.3.1 把握時(shí)機(jī)，因勢利導(dǎo) 疾病可以擾亂體內(nèi)的生理節(jié)律，也可以使這些節(jié)律的出現(xiàn)提前或推遲。因此從這種意義上說，疾病的過程是由生理節(jié)律到病理節(jié)律的轉(zhuǎn)化過程。故而如果能在機(jī)體功能相對旺盛的時(shí)候用藥，就能借助機(jī)體自身的抗病能力，在祛除外邪的同時(shí)，造成一種與機(jī)體“自由節(jié)律”樣的同步人工漲落，從而誘導(dǎo)其重新恢復(fù)疾病前的正常節(jié)律，重新進(jìn)入有序的陰陽消長轉(zhuǎn)化軌跡，使疾病向痊愈的方向發(fā)展?！疤柌∮鈺r(shí)，從巳至未上”。臨床治療太陽病就應(yīng)選擇在上午9～11時(shí)使用解表藥。此時(shí)白介素含量表達(dá)也低，機(jī)體抗病能力強(qiáng)，同時(shí)陽氣浮盛于體表，抗邪力量強(qiáng)，腠理易開，有助于驅(qū)散表邪，藥物可憑借陽氣升浮外達(dá)之際使疾病汗出而愈，所以選擇此時(shí)服藥治療，可以增強(qiáng)藥物的療效。臨床已經(jīng)有午前服用桂枝湯治療太陽病以提高療效的報(bào)道。如張玉才[3]用桂枝湯分別在上午11時(shí)和晚上20時(shí)服藥治療太陽中風(fēng)證，結(jié)果上午11時(shí)服藥組效果與時(shí)間有明顯的相關(guān)性，；而20時(shí)服藥組效果與時(shí)間關(guān)系不大。崔慧娟[4]認(rèn)為，正午服用桂枝湯治療發(fā)熱患者效果明顯。

3.3.2 提高臨床療效，減少毒副作用 太陽病在“欲解時(shí)”機(jī)體功能相對旺盛，對藥物的反應(yīng)較敏感，如果選擇在此時(shí)給藥，就可使藥物發(fā)揮更大的作用；對于毒副作用較強(qiáng)的藥物，就可適當(dāng)減少劑量，減輕毒副作用。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)研究也表明[5]，桂枝湯解熱作用最明顯的為白晝，鎮(zhèn)痛作用最明顯的也在白晝，而毒性作用主要在夜間。

綜上所述，人體生理結(jié)構(gòu)及其機(jī)能活動與天地自然相應(yīng)，而自然界固有的時(shí)序特點(diǎn)，也必然會對人體之生理、病理構(gòu)成影響，并直接與疾病診治和預(yù)防相關(guān)。開展中醫(yī)理論的現(xiàn)代研究來分析人體生理、病理與時(shí)序、節(jié)律的相關(guān)性，并進(jìn)而探索相應(yīng)的診斷、治療和預(yù)防方法是非常必要的。

[1] 楊士友,孫備,裴月梅.風(fēng)寒表證和寒凝血瘀證動物模型的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,1997,3(1)：54-56.

[2] 胡劍北,胡仲英,胡劍東,等.中西醫(yī)結(jié)合時(shí)間醫(yī)學(xué)[M].合肥:安徽科學(xué)出版社,2008:75.

[3] 張玉才.談桂枝湯的服藥時(shí)間[J]．山東中醫(yī)雜志,1987,6(5)：6.

[4] 崔慧娟,翟雙慶．依時(shí)辰治病的臨床應(yīng)用[J]．河南中醫(yī),1992,12(4):179-180.

[5] 胡劍北,胡仲英,胡劍東,等.中西醫(yī)結(jié)合時(shí)間醫(yī)學(xué)[M].合肥：安徽科學(xué)出版社,2008:282.