張玉人，林洪生，張 英

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院,北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

乳腺癌系女性最常見的惡性腫瘤，在歐美國家乳腺癌約占女性新發(fā)惡性腫瘤的29%，而死亡率約占14%～15%[1]，其轉移及復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。而腫瘤的形成、侵襲性及復發(fā)轉移行為，與癌細胞、炎性細胞因子、細胞外基質、成纖維細胞、免疫抑制細胞等構成的腫瘤微環(huán)境密切相關。研究結果顯示，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)與炎癥密切相關，是介導促炎細胞如Th17、Th9等分化的關鍵因子之一[2]；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)與炎癥具有一定相輔相成關系[3]，二者在腫瘤微環(huán)境下相互調節(jié)；基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9, MMP-9)是重要的炎癥介質，可促腫瘤細胞侵襲并與血管生成密切相關[4]；而單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)是β亞家族代表，可趨化單核細胞。

浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)為百合科貝母屬植物干燥鱗莖，藥性苦寒，具有清熱化痰、解毒散結及抗炎功效。浙貝母堿(verticine)包括貝母素甲(Peimine)及貝母素乙(Peiminine)為其主要成分。由于4T1細胞為鼠源炎性乳腺癌細胞系，故以該細胞為實驗對象擬研究貝母素甲及貝母素乙對乳腺癌細胞炎癥相關腫瘤微環(huán)境的干預調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠4T1乳腺癌細胞株購自中科院上海細胞生物研究所。

1.1.2 主要試劑及藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購于建成公司；含血清培養(yǎng)基(serum-supplemented medium, SSM)為10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基； ELISA-TGFβ、VEGF、MMP-9、CBA-MCP-1試劑盒均購自R&D公司。Trizol、Reverse Transcribe High Capacity RNA-to-cDNA Kit、Gene Expression Master Mix、TGF-β1(Mm01178820_m1)、 VEGF(Mm01281449_m1)、MMP-9(Mm00442991_m1)、GAPDH (Mm99999915_g1)試劑盒及Taqman定制探針均購自life technologies公司。

貝母素甲、貝母素乙標準品(中國藥品檢驗所)、順鉑注射液(云南個舊生物制藥有限公司)。

1.1.3 主要儀器 實驗所需主要儀器包括5% CO237℃恒溫細胞培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、Applied Biosystems Real-Time PCR 7500 System(ABI公司)、酶標儀(synergy HT, Biotek公司)、倒置顯微鏡(Nikon TE2000-U)。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 將20 mg貝母素甲、乙標準品溶于甲醇溶劑，總濃度5 mg/ml；順鉑200 mg溶于0.9%NaCl溶液，總濃度0.3 mg/ml。

1.2.2 乳腺癌4T1細胞株培養(yǎng) 復蘇4T1細胞株，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置5% CO237℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代至對數生長期。

1.2.3 Cell Counting Kit-8 檢測 取對數生長期細胞將濃度調整為2×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 24 h后棄去培養(yǎng)液，分別加入含貝母素甲、貝母素乙藥品溶液及順鉑培養(yǎng)基200 μl/孔，貝母素甲、乙梯度濃度分別為5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L、100 μM/L；順鉑梯度濃度為0.1 μM/L、0.3 μM/L、1 μM/L、3 μM/L、10 μM/L、30 μM/L、100 μM/L；陰性對照組加入200 μl培養(yǎng)基，空白對照組不含細胞，各濃度均設6復孔。于加藥后24 h、48 h、72 h分別加入CCK-8試劑，每孔10 μl，2 h后以酶標儀檢測記錄450 nm及630 nm吸光度值(A)，計算細胞不同時間、不同藥物濃度的抑制率。抑制率(%)=[(陰性對照組A-空白對照組A)-(實驗組A-空白對照組A)]/(陰性對照組A-空白對照組A)×100%。

1.2.4 炎性微環(huán)境相關因子水平檢測 炎性微環(huán)境相關炎性因子及蛋白的含量主要通過酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)進行檢測。具體指標為轉化生長因子β(TGFβ)、血管內皮生長因子(VEGF)、金屬基質蛋白酶9(MMP-9)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)共4項指標。

將處于對數生長期4T1細胞接種于6孔板，設置貝母素甲、乙、順鉑及陰性對照組，以貝母素甲、乙及順鉑IC50(24 h)劑量干預4T1細胞24 h后提取上清，各組樣本設置3復孔，使標準品及樣本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物，洗滌后每孔加入100 μl 酶標抗體，孵育2 h使固相免疫復合物上抗原與酶標抗體結合，避光加入100 μl酶催化底物，孵育30 min以100 μl 酸性酶反應終止液終止反應，根據顏色反應程度進行檢測指標的定性及定量。酶標儀檢測吸光度值A(檢測波長為450 nm，矯正波長為570 nm)，將檢測結果在EXCEL軟件中轉化為濃度進行統計分析。

1.2.5 實時熒光定量(RT-PCR)法檢測 將細胞接種于6孔板1×105個/孔，根據兩步法Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，以逆轉錄反應體系合成cDNA，將cDNA為模板使用熒光探針進行PCR擴增，包括TGF-β1 (Mm01178820_m1)、VEGF (Mm01281449_m1)及MMP-9(Mm00442991_m1)，GAPDH(Mm99999915_g1)為內參基因，依據RT-PCR反應曲線閾值循環(huán)數(ct)及RQ值相對定量，計算公式為：2-△△ct。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 Cell Counting Kit-8檢測結果

圖1顯示，5 μM/L、10 μM/L、20 μM/L、50 μM/L、60 μM/L、80 μM/L及100 μM/L貝母素甲、貝母素乙及順鉑干預4T1細胞24 h、48 h、72 h時抑制率，其中48 h貝母素甲、乙及順鉑IC50濃度分別為14.7 μM/L、 29 μM/L及 13 μM/L。

2.2 ELISA法各指標檢測結果

表1顯示，TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1檢測結果如表1所示。無藥物干預對照組4T1乳腺癌細胞對炎癥相關因子TGF-β、VEGF、MMP-9及MCP-1分泌量較高，貝母素甲組TGF-β、VEGF及MCP-1分泌量顯著降低(P<0.05,P<0.01)；貝母素乙組TGF-β, MMP-9及MCP-1分泌量比較對照組顯著降低(P<0.05,P<0.01)；順鉑組各指標均顯著下降(P<0.01)。

2.3 RT-PCR檢測結果

圖1注：A. 各濃度貝母素甲24 h、48 h、72 h對4T1細胞抑制率；B. 各濃度貝母素乙24 h、48 h、72 h對4T1細胞抑制率；C. 各濃度順鉑24 h、48 h、72 h對4T1細胞抑制率

炎癥相關因子對照組貝母素甲貝母素乙順鉑TGF-β0.621±0.0110.424±0.024**0.321±0.01**0.248±0.015**VEGF0.177±0.0030.158±0.008*0.202±0.010.015±0.003**MMP-97.108±0.4415.975±1.6015.615±0.067*5.048±0.013**MCP-10.326±0.0090.193±0.004**△△0.154±0.004**△△0.371±0.001**

注：與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01； 與順鉑組比較:△P<0.05,△△P<0.01

表2 各組細胞中TGF-β、VEGF、MMP-9的mRNA相對表達量

注：與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01； 與順鉑組比較:△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

惡性腫瘤的增殖、侵襲及轉移與其炎性相關腫瘤微環(huán)境存在密切聯系，近年來已成為研究熱點。4T1細胞為高轉移、三陰性乳腺癌細胞系，可分泌多種炎性相關因子，故本研究以4T1細胞為觀察對象，探索中藥單體貝母素甲和貝母素乙對4T1細胞及其相關炎性微環(huán)境的調控作用。

經研究顯示，TGF-β是介導炎癥強有力的趨化因子[5]，參與誘導Th17分化，促進炎癥反應；而炎癥與血管生成密切相關[6]，血管生成調節(jié)因子在各種炎癥狀態(tài)及促腫瘤生成和轉移過程中均發(fā)揮著重要作用，其中VEGF不僅能夠促血管內皮細胞生長、誘導異常血管生成[7]，且可抑制細胞凋亡，增加血管通透性，促腫瘤細胞轉移；金屬基質蛋白酶家族尤其是MMP-9作為炎癥介質也參與了血管異常生成和細胞外基質降解，能夠促進腫瘤細胞侵襲及遷移。這些炎癥相關細胞因子對乳腺癌的浸潤與轉移發(fā)揮了至關重要的作用。

中藥浙貝母具有清熱解毒散結及抗炎功效，在乳腺癌的臨床治療中廣泛應用，而貝母素甲、乙均為浙貝母堿主要成分之一。經本實驗結果證明，貝母素甲及貝母素乙對4T1乳腺癌細胞具有顯著抑制作用，并可有效降低炎性相關因子分泌及其 mRNA相對表達量，發(fā)揮抑炎功效?？梢哉J為，中藥單體貝母素甲、乙作為浙貝母有效成分，能夠對乳腺癌細胞炎性微環(huán)境起到調控作用。此外，通過本次研究進一步挖掘了浙貝母的抗腫瘤功效，并對其藥物有效成分的開發(fā)和利用提供了基礎實驗依據。

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