王月華，潘利敏，方 超，張江華，陳志強(qiáng)，李 英，趙玉庸

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊 050081；2. 河北省中醫(yī)院，石家莊 050011；3. 河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017)

腎為絡(luò)脈聚集之所，“久病入絡(luò)”為腎臟病發(fā)展的中心環(huán)節(jié)之一。本課題組以“久病入絡(luò)”理論為指導(dǎo)，提出氣陰兩虛、癥積絡(luò)阻為糖尿病腎病(DN)的基本病機(jī)，以益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為DN的治療大法。而前期研究已證實(shí)，該法能夠通過(guò)對(duì)DN大鼠TGF-β/Smads、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及RAS系統(tǒng)的影響發(fā)揮對(duì)DN的治療作用[1～3]。有研究表明，足細(xì)胞裂孔膜蛋白如nephrin等的表達(dá)異常，與蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)[4，5]。因此，本研究繼以DN動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察腎絡(luò)通(益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)為法)對(duì)DN大鼠24 h尿白蛋白及足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin的影響，為中藥復(fù)方制劑延緩DN提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)研究選用清潔級(jí)雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量(200±10) g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)1312053)。

1. 2 主要藥物與試劑

腎絡(luò)通由黃芪、玄參、地龍、僵蠶、烏梢蛇等組成，經(jīng)粉碎、水煎濃縮至含生藥3 g/ml(河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院制劑室提供)。厄貝沙坦(由杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn))、兔抗大鼠nephrin蛋白抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及鏈酶親和素-生物素復(fù)合素(北京中杉公司)。

1.3 主要儀器

代謝籠(蘇州工業(yè)園唯亭姑秀動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、One Touch UltraⅡ穩(wěn)豪型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)、全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)、電子天平(德國(guó)賽多利電子天平有限公司)、三洋低溫冰箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)、電腦三恒電泳儀(北京六一儀器廠)、電子顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)基因有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模及給藥方法 70 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后分別置代謝籠里取尿，并測(cè)定尿蛋白及尿紅細(xì)胞全部陰性， 隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，其余60 只大鼠均行腹腔注射STZ(55 mg·kg-1·d-1) 1次，3 d后測(cè)空腹血糖≥16.7 mmol/L者，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組及厄貝沙坦組開(kāi)始灌胃給藥。中藥組給予11.2 g·kg-1·d-1，厄貝沙坦組給予15 mg·kg-1·d-1(給藥劑量參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算)。分別在實(shí)驗(yàn)第24 周于代謝籠里留取24 h 尿后，股動(dòng)脈取血并取右側(cè)腎組織待測(cè)。

1.4.2 Western 印跡方法檢測(cè)nephrin蛋白表達(dá) 用RIPA蛋白裂解液提取腎組織總蛋白，采用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。取腎組織裂解蛋白50 μg，經(jīng)15% SDS-PAGE 垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗4℃過(guò)夜，加二抗室溫2 h；TBST 洗膜10 min×3次， DAB 顯色，Gene 圖像分析儀攝像、分析，目的蛋白相對(duì)含量以目的蛋白/β-actin(內(nèi)參) 的灰度比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組、中藥組及厄貝沙坦組各有1只大鼠血糖恢復(fù)正常并剔除。正常對(duì)照組大鼠飲食正常，眼睛有神，被毛光澤，反應(yīng)敏捷，糞便呈麥粒狀，尿量正常。造模各組注射STZ后，均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并逐漸出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、身體消瘦。治療期間造模各組均有大鼠死亡情況，其中模型組和中藥組死亡3只，厄貝沙坦組死亡2只，死亡原因估計(jì)為高血糖引起的代謝紊亂。

2.2 各組大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、24 h尿白蛋白定量(24 h U-Alb)比較

與正常對(duì)照組比較，模型組、厄貝沙坦組、中藥組FBG、HbA1c、24 h U-Alb顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，厄貝沙坦組、中藥組FBG、HbA1c比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，厄貝沙坦組、中藥組24 hU-Alb均有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，厄貝沙坦組與中藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠FBG、HbA1c、U-Alb和 nephrin /β-actin 比較

注：與正常對(duì)照組比較：P<0.01；與模型組比較：**P<0.01

2.3 各組腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察

圖1顯示，正常對(duì)照組腎組織未見(jiàn)明顯病理改變，模型組、中藥組及厄貝沙坦組大鼠可見(jiàn)腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增加，腎小球基膜增厚，腎小囊腔變窄，各治療組病理改變較模型組輕。

圖1 各組大鼠光鏡下病理形態(tài)學(xué)結(jié)果(PAS染色，×400)A為正常對(duì)照組，B為模型組，C為厄貝沙坦組，D為中藥組

2.4 各組腎皮質(zhì)nephrin蛋白表達(dá)比較

表1圖2顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組、中藥組及厄貝沙坦組Nephrin蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。與模型組比較，厄貝沙坦組和中藥組Nephrin蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。說(shuō)明厄貝沙坦、中藥可增加Nephrin蛋白表達(dá)水平，厄貝沙坦組與中藥組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組大鼠腎組織nephrin蛋白表達(dá)

3 討論

糖尿病腎病是常見(jiàn)的糖尿病微血管?chē)?yán)重并發(fā)癥之一，是西方國(guó)家終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)及進(jìn)行腎替代治療的最主要原因[7]。在我國(guó)DN在ESRD中的比例也逐漸上升，預(yù)計(jì)在未來(lái)的20年DN將成為終末期腎衰竭最重要的原因[8]，因此探索新的藥物仍是亟待解決的問(wèn)題。課題組結(jié)合“病久必瘀、病久入絡(luò)”的中醫(yī)學(xué)理論，提出該病證病位在絡(luò)，“瘀血癥積阻于腎絡(luò)”可能是病機(jī)關(guān)鍵，同時(shí)結(jié)合DN氣陰兩虛的基本病機(jī)，經(jīng)過(guò)臨證的反復(fù)篩選，確定了相對(duì)固定治療DN的基本方腎絡(luò)通，以消癥通絡(luò)為主，兼以益氣養(yǎng)陰。其中黃芪、玄參益氣養(yǎng)陰，地龍、僵蠶、烏梢蛇、鱉甲等消癥通絡(luò)，取得了較好的臨床療效。本研究中我們觀察到，該方可顯著減少DN大鼠尿白蛋白，與厄貝沙坦比較降尿蛋白作用相當(dāng)，今后我們將進(jìn)一步研究二者的協(xié)同效應(yīng)，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但與模型組比較，厄貝沙坦組、中藥組FBG、HbA1c無(wú)明顯降低，我們推測(cè)該方保護(hù)腎功能的作用不依賴(lài)于糖代謝。

研究表明，大量蛋白尿的發(fā)生是糖尿病腎組織損傷的典型標(biāo)志，腎小球基底膜受損僅導(dǎo)致隱匿性或少量的蛋白丟失，而足細(xì)胞損傷則導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜完整性喪失和大量蛋白漏出，足細(xì)胞在蛋白尿發(fā)生中起重要作用。而足細(xì)胞足突間裂孔隔膜的完整性是決定腎小球?yàn)V過(guò)屏障通透性的關(guān)鍵，裂孔隔膜上的裂孔膜蛋白與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)[9]。大量證據(jù)表明，nephrin是將裂孔膜錨定于足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架上的關(guān)鍵功能單位，是維持腎小球正常濾過(guò)功能的必要條件[10,11]。綜合以上研究，足細(xì)胞損傷在DN中已經(jīng)確定。探索以足細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療機(jī)制, 對(duì)探討新的DN治療和預(yù)防手段具有極其重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第24周造模各組nephrin蛋白顯著下降，與上述報(bào)道一致。而進(jìn)一步觀察模型組nephrin 蛋白表達(dá)低于其他各組，中藥組及厄貝沙坦組均能使腎組織中nephrin 蛋白表達(dá)上調(diào),提示益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥及厄貝沙坦可能通過(guò)減少nephrin蛋白的丟失,使腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性得到一定程度的恢復(fù)而減輕蛋白尿。中藥組與厄貝沙坦組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中藥長(zhǎng)期療效發(fā)揮有待進(jìn)一步研究。

[1] 王月華，陳志強(qiáng)，郭登洲，等. 益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的影響[J]. 中草藥，2009,40(4)：606-608.

[2] 郭立芳，王鳳麗，王月華，等. 益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)方對(duì)糖尿病腎病大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2012,32(11):2336-2337.

[3] 郭登洲，王月華，邊東，等. 活血化瘀消癥通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病腎病大鼠血管緊張素系統(tǒng)的影響[J].中醫(yī)雜志，2010,51(1)：75-78.

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