胡旭軍，劉 鵬，許兆軍，許小敏

(寧波市第二醫(yī)院,浙江 寧波 315010)

筆者選取我院住院病人的臨床標(biāo)本分離到一組耐藥移動克雷伯菌,為了解該組菌株的β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因存在狀況,進行了相關(guān)基因檢測和突變分析,耐藥元件檢測結(jié)果進行了樣本聚類分析，現(xiàn)報告如下。

一、材料與方法

(一)菌種鑒定。

由2012年1月-2012年12月我院重癥監(jiān)護病房住院患者中分離菌株。使用全自動微生物鑒定儀初步篩查，然后作gyrA與parC基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增測序。測得序列經(jīng)GenBank比對確認(rèn)為移動克雷伯菌者。

(二)藥敏試驗。

K-B法及VITEK2-compact分析系統(tǒng)的藥敏卡AST-GN13。判斷依據(jù)參照2012年CLSI。

(三)基因檢測模板制備。

取單個菌落置于預(yù)置4ml濃度為200g/L蛋白酶K溶液的離心管中，加蓋后置于56℃水浴中2h，隨后，放入95℃水浴中10min，即為基因檢測模板，模板放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(四)基因檢測。

PCR基因檢測法測定耐藥相關(guān)基因以及gyrA、parC基因；氟喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA與parC經(jīng)PCR擴增另作DNA測序。判斷產(chǎn)物陽性。

(五)陽性基因測序。

3730型毛細血管全自動測序儀進行PCR產(chǎn)物直接全自動熒光法。

(六)測得序列比對。

讀序軟件為Chromas。測序結(jié)果用Chromas直接作Search比對。

(七)聚類分析。

耐藥相關(guān)基因檢測結(jié)果及耐藥決定區(qū)突變分析結(jié)果作樣本聚類分析(Neighbour-Joining法)。

二、結(jié) 果

具體檢測結(jié)果如下(見附表、附圖)。

附表 24株耐藥移動克雷伯菌39種水平轉(zhuǎn)移獲得與β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類耐藥相關(guān)基因檢測結(jié)果及gyrA與parC之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析結(jié)果

注：標(biāo)*者均經(jīng)測序證實；檢測為陰性基因的項目表內(nèi)未列出

三、討 論

本次實驗中24株耐藥移動克雷伯菌的β-內(nèi)酰胺酶基因和氨基糖苷類修飾酶基因，均測得陽性結(jié)果。gyrA與parC之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變率均大于50%。可見本組移動克雷伯菌耐藥表型有著確鑿的遺傳學(xué)背景[1]。

樣本聚類分析用作解析一組數(shù)據(jù)中樣本之間的關(guān)系[2],在本文中亦即菌株間的親緣關(guān)系，本組中耐藥移動克雷伯菌菌株同時存在克隆和演化。1-6-13-14號株為克隆播散(已構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,16號株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點A),16號株攜帶TEM+CTX-M-1群+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,1-6-13-14號與16號株有共同的祖先。3-4號株為克隆播散(未構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶tnp-TEM+gyrA(83位)突變+parC(80位)突變,15號株與該克隆關(guān)系最近(圖1中結(jié)點B),15號株攜帶tnp-TEM+aac(6’)-Ⅰb+gyrA(83位)突變+parC(80位)

附圖 24株耐藥移動克雷伯菌耐藥元件測得結(jié)果樣本聚類分析

突變,3-4號與15號株有共同的祖先。8-17號株為克隆播散(未構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM+SHV+gyrA(83位,87位)突變+parC(80位)突變,5號株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點C),5號株攜帶TEM+gyrA(83位,87位)突變+parC(80位)突變,8-17號與5號株有共同的祖先。2-10-12-18-19-20-22-23-24號株為克隆播散(已構(gòu)成暴發(fā)流行),并攜帶TEM,21號株與該克隆關(guān)系最近(附圖中結(jié)點D),21號株攜帶TEM+gyrA(83位)突變,2-10-12-18-19-20-22-23-24號與21號株有共同的祖先。樣本聚類分析顯示本組耐藥移動克雷伯菌存在4個克隆播散,其中2個已構(gòu)成已構(gòu)成暴發(fā)流行。

最新的研究發(fā)現(xiàn),移動克雷伯菌具有較強黏附性和侵襲性,并致單核細胞凋亡[3],我國已有移動克雷伯菌致肝移植者肝膿腫的報告[4-5]，值得深入關(guān)注。

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