陳京京,姜 宏，李 攀

(安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230031)

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer)不僅可提高胚胎利用率和累計(jì)妊娠率，而且有效降低了新鮮周期控制性超排卵所導(dǎo)致的并發(fā)癥如卵巢過度刺激綜合征等，已成為輔助生殖技術(shù)中重要的組成部分[1]。近年來，序貫培養(yǎng)技術(shù)使囊胚培養(yǎng)和移植成為可能，囊胚移植使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育同步，更符合子宮的生理著床環(huán)境，不僅提高胚胎種植率和臨床妊娠率，并且可通過限制移植囊胚數(shù)目達(dá)到既可獲得較高的累積妊娠率，又可減少多胎妊娠及其他母嬰并發(fā)癥發(fā)生的目的[2]。凍融囊胚歷經(jīng)了冷凍和復(fù)蘇的考驗(yàn)，能夠存活表明其具有更強(qiáng)的生命力和發(fā)育潛能，有更高的種植率和臨床妊娠率[3]。本研究通過518個凍融胚胎移植周期臨床資料的回顧性分析，旨在探討冷凍周期囊胚移植的臨床價值以及凍融卵裂期胚胎復(fù)蘇后行囊胚移植的應(yīng)用前景。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2012年9月至2013年7月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心接受凍融胚胎移植患者共518個周期的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡均小于或等于38歲。(2)均采用長方案進(jìn)行控制性超促排卵。按移植凍融胚胎類型分為3組，A組：凍融囊胚移植，共129個周期；B組：卵裂期胚胎復(fù)蘇后行囊胚培養(yǎng)后移植，共123個周期；C組(對照)：凍融卵裂胚移植，共266個周期。比較3組間的臨床結(jié)局及A、B兩組新鮮周期胚胎和凍融周期的囊胚形成率和取消率。3組間患者的平均年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)性激素水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

1.2方法

1.2.1胚胎評分和冷凍 根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)和碎片數(shù)目將第3天的卵裂期胚胎分為4級：Ⅰ級：碎片小于5%；Ⅱ級：5%～<20%；Ⅲ級：20%～<50%；Ⅳ級：碎片大于或等于50%，其中6/Ⅱ級以上定義為優(yōu)質(zhì)胚胎；根據(jù)文獻(xiàn)[1]進(jìn)行囊胚分級，將3BB 以上囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。按照知情同意的原則，選擇第3天剩余3枚以上5/Ⅲ級的胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，對第3天優(yōu)質(zhì)胚胎和第5天 3BC或3CB以上囊胚進(jìn)行冷凍。卵裂期胚胎和囊胚均采用玻璃化冷凍法進(jìn)行冷凍，囊胚冷凍前先行激光打孔人工皺縮。

1.2.2胚胎復(fù)蘇和凍融囊胚移植 胚胎冷凍3個月后行凍融囊胚移植，所有患者均采用激素替代法準(zhǔn)備內(nèi)膜，即月經(jīng)周期第3天起口服戊酸雌二醇(商品名：補(bǔ)佳樂，拜耳)4～6 mg/d，第10天陰道超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)內(nèi)膜生長情況調(diào)整戊酸雌二醇用量，最大劑量10 mg/d，當(dāng)內(nèi)膜厚度大于或等于8 mm時，給予肌內(nèi)注射黃體酮40 mg/d轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，3 d后選擇2～3枚存活卵裂期胚胎移植，或5 d后選擇1～2枚存活囊胚移植。存活卵裂期胚胎標(biāo)準(zhǔn):完整細(xì)胞數(shù)大于50%，存活囊胚標(biāo)準(zhǔn)為囊胚腔的恢復(fù)和擴(kuò)張。A組與C組胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2 h移植，B組卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2～3 d移植，移植后14 d測血或尿人絨毛膜促性腺激素，陽性者為生化妊娠，移植5周后B超檢查發(fā)現(xiàn)孕囊確診為臨床妊娠，妊娠12周內(nèi)胚胎停止發(fā)育或流產(chǎn)定義為早期流產(chǎn)。

2 結(jié) 果

2.13組患者的臨床結(jié)局 A、B組的生化妊娠率(70.5%vs.67.5%)、臨床妊娠率(61.2%vs.58.2%)和胚胎種植率(42.3%vs.40.2%)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均顯著高于C組(53.0%、42.5%、23.1%)(P<0.05)。3組間早期流產(chǎn)率、異位妊娠率、多胎妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組患者的一般資料和臨床結(jié)局比較

a:P<0.05，與A、B組比較。

2.2新鮮胚胎與凍融胚胎的囊胚形成率比較 新鮮胚胎行囊胚培養(yǎng)237個周期共2 388枚胚胎，其中11個周期未形成囊胚放棄移植和冷凍，周期取消率為4.6%(11/237)，培養(yǎng)后獲得囊胚1 081枚，囊胚形成率為45.3%(1 081/2 388)。根據(jù)第3天胚胎質(zhì)量分為優(yōu)質(zhì)胚胎組和非優(yōu)質(zhì)胚胎組，優(yōu)質(zhì)胚胎組共1 413枚胚胎，培養(yǎng)后獲883枚囊胚，囊胚形成率為62.5%(883/1 413)；非優(yōu)質(zhì)胚胎組共975枚胚胎，培養(yǎng)后獲198枚囊胚，囊胚形成率為20.3%(198/975)。凍融卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)139個周期共421個胚胎，其中16個周期未形成囊胚放棄移植，周期取消率為11.5%(16/139)，培養(yǎng)后獲243枚囊胚，囊胚形成率為57.7%(243/421)，顯著高于新鮮周期組(P<0.05)。優(yōu)質(zhì)胚胎組和凍融胚胎組的囊胚形成率均顯著高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組(P<0.05)，而前兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

3.1凍融囊胚移植與凍融卵裂期胚胎囊胚培養(yǎng)的臨床意義 囊胚是胚胎發(fā)育的重要階段，只有質(zhì)量較好的胚胎才能發(fā)育到囊胚階段，而發(fā)育潛能差、染色體異常的胚胎常在4～8細(xì)胞階段出現(xiàn)發(fā)育阻滯，被自然淘汰。8細(xì)胞前的胚胎主要依賴母源性基因生長，8細(xì)胞后胚胎基因組活化，主要依賴胚胎自身基因生長，有更高的發(fā)育潛能[4]。通過囊胚培養(yǎng)可進(jìn)一步淘汰發(fā)育潛能差和具有遺傳缺陷的胚胎，增加胚胎的體外篩選機(jī)會，獲得更好的臨床結(jié)局。馬文敏等[5]的結(jié)果顯示,囊胚移植的胚胎數(shù)雖顯著低于卵裂期胚胎,但臨床妊娠率卻顯著高于卵裂期胚胎(52.5%vs.30.0%)。

在體外受精超促排卵過程中，子宮內(nèi)膜的成熟較自然周期提前2～4 d，而子宮內(nèi)膜成熟提前3 d以上的移植周期均未獲得妊娠[6]。囊胚移植可使胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜“種植窗”同步，更符合生理著床時間，同時縮短胚胎移植入子宮腔與著床的時間間隔，且該階段子宮收縮頻率減少，降低了胚胎被排出體外的概率，有利于胚胎著床。本研究的結(jié)果也證實(shí)，雖然A組移植胚胎數(shù)低于C組，但生化妊娠率、臨床妊娠率、胚胎種植率高達(dá)70.5%、61.2%和42.3%，均顯著高于C組。

由于凍融囊胚移植具有較好的臨床結(jié)局和累計(jì)妊娠率，作者對部分復(fù)蘇后存活3枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的患者進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，以探討凍融后卵裂期胚胎的發(fā)育潛能及對凍融周期臨床結(jié)局的改善作用。Eftekhar等[7]的結(jié)果顯示，復(fù)蘇后卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)能夠提高繼續(xù)妊娠率，改善臨床結(jié)局。本研究的結(jié)果顯示，復(fù)蘇后存活卵裂期胚胎的囊胚形成率高于新鮮周期，且臨床妊娠率與凍融囊胚移植相近，顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。推測可能與其冷凍前即為優(yōu)質(zhì)胚胎，復(fù)蘇后存活表明其能夠經(jīng)過低溫冷凍和復(fù)蘇的考驗(yàn)，具有更高的發(fā)育潛能，不僅囊胚形成率高而且移植后臨床妊娠率也顯著提高，可獲得與凍融囊胚相近的臨床結(jié)局[8]。建議凍融周期解凍有3個以上存活優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)后移植，不僅可對凍融胚胎進(jìn)行體外篩選，而且可獲得更好的妊娠結(jié)局。

輔助生殖技術(shù)臨床應(yīng)用的并發(fā)癥之一就是增加了異位妊娠的發(fā)生率，可高達(dá)5%[9]，而自然妊娠僅為1%～2%。日本學(xué)者加藤修[10]發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎移植后可隨子宮內(nèi)膜分泌液強(qiáng)流進(jìn)入輸卵管，在輸卵管內(nèi)發(fā)育成囊胚，在孕激素的作用下，子宮內(nèi)膜分泌液流變?nèi)酰咛ピ谳斅压芾w毛的蠕動下重新回到子宮腔內(nèi)著床。當(dāng)輸卵管發(fā)生病變，蠕動功能異常時，發(fā)生異位妊娠的可能性增大。而囊胚移植由于時間推后，黃體酮水平升高避開了子宮分泌液的強(qiáng)流和宮縮導(dǎo)致的負(fù)壓，可有效降低異位妊娠的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，凍融囊胚移植和凍融卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)后移植的異位妊娠率均低于凍融卵裂期胚胎移植，但兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2胚胎質(zhì)量與囊胚形成率 新鮮周期移植后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)不僅能夠?qū)κＳ嗯咛ミM(jìn)行有效篩選，而且在凍融周期移植可顯著提高種植率和臨床妊娠率[11]。由于只有30%～50%的優(yōu)質(zhì)胚胎能夠形成囊胚[12]，囊胚培養(yǎng)的主要弊端就是培養(yǎng)過程中導(dǎo)致的胚胎損耗以及長時間培養(yǎng)導(dǎo)致透明帶的變化，甚至出現(xiàn)無囊胚形成的潛在風(fēng)險。Hardy等[13]認(rèn)為，胚胎的質(zhì)量影響囊胚形成率、囊胚質(zhì)量和種植率。胚胎碎片不僅干擾細(xì)胞之間的連接，不利于細(xì)胞的融合、囊胚腔和囊胚的形成[14]，而且釋放的有毒物質(zhì)損傷其臨近的細(xì)胞，減少胞質(zhì)的體積并耗竭胚胎發(fā)育所需的細(xì)胞器，造成卵裂球或胞質(zhì)的損失，最終凋亡。隨著胚胎碎片的增多，囊胚形成率降低，囊胚質(zhì)量下降。本研究也發(fā)現(xiàn)，第3天優(yōu)質(zhì)胚胎的囊胚形成率(62.5%)顯著高于非優(yōu)質(zhì)胚胎(20.3%)，因此，對第3天大于或等于3個優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，理論上至少可獲得1～2枚囊胚，從而確保囊胚培養(yǎng)的成功。對于第3天形態(tài)學(xué)評分低的胚胎進(jìn)行體外延長培養(yǎng)仍有一部分能越過阻滯期發(fā)育到囊胚，從中篩選出具有發(fā)育潛能、生存能力強(qiáng)、質(zhì)量好的胚胎。本研究對246枚第3天2細(xì)胞或3細(xì)胞胚胎進(jìn)行了觀察，僅有3枚形成囊胚，囊胚形成率僅為1.2%，表明該類胚胎幾乎不具備發(fā)育為囊胚的潛能。

總之，本研究認(rèn)為凍融囊胚移植與凍融卵裂期胚胎復(fù)蘇后行囊胚培養(yǎng)后移植可獲得較好的臨床結(jié)局，尤其解凍卵裂期胚胎行囊胚培養(yǎng)可獲得較高的囊胚形成率和妊娠率，建議對復(fù)蘇后存活3枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎的患者行囊胚培養(yǎng)后移植。

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