孟凡勇，馬俊英，陳 萍

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第三附屬醫(yī)院普外科，河南漯河462002）

腫瘤是引起目前人類死亡的主要原因，其中胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)隨著生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加、發(fā)病年齡趨向年輕化的趨勢(shì)［1］。胃癌發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了由量變到質(zhì)變、漸變到突變的連續(xù)發(fā)展過(guò)程，期間涉及到癌基因的激活或者抑癌基因的失活，表觀遺傳學(xué)修飾可以調(diào)控基因的表達(dá)，DNA甲基化是一種基因主要的表觀遺傳學(xué)修飾形式［2］，近期的研究顯示抑癌基因啟動(dòng)子的過(guò)度甲基化是抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制，Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家 族 基 因1A （ras associated domain family gene 1A，RASSF1A）是近年來(lái)已經(jīng)確認(rèn)的一個(gè)抑癌基因，本研究檢測(cè)了胃癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的情況，以探討其與胃癌的關(guān)系，以期為胃癌的早期預(yù)防及分子靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一、第二、第三附屬醫(yī)院2003年2月至2013年10月保存的200例胃癌患者的胃癌組織蠟塊，其中，男124例，女76例，年齡41～77 歲，平均（64.2±12.3）歲，所有病例均經(jīng)病理確診為胃腺癌，均行胃癌根治術(shù)。另取30例胃潰瘍切除患者的正常胃壁組織作為對(duì)照，所有病例均經(jīng)病理確診未見(jiàn)腫瘤組織，其中，男19例，女11例，年齡39～76 歲，平均（63.1±11.8）歲。兩組患者在性別、年齡、臨床資料方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 組織蠟塊DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)基因公司，DNA甲基化修飾試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)引物和甲基化特異性PCR（MSP-PCR）反應(yīng)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖購(gòu)自上?？道锟萍技夹g(shù)有限公司。9700 PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.2.2 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的檢測(cè) 調(diào)取石蠟包埋組織標(biāo)本，嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作提取各個(gè)標(biāo)本的基因組DNA，DNA甲基化修飾試劑盒對(duì)基因組1μg DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，使用甲基化以及非甲基化引物進(jìn)行MSP-PCR反 應(yīng)，RASSF1A甲基化引物，正向：5′-GGG TIT TGC GAG AGC GCG-3′，反向：5′-GCT AAC AAA CGC GAA CCG-3′；RASSF1A非甲基化引物，正向：5′-GGT TTT GTG AGA GTG TGT TTA G-3′，反向：5′-CAC TAA CAA ACA CAA ACC AAA C-3′。MSP-PCR反應(yīng)體系為25μL，MSPPCR反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃60 s，65 ℃30 s，72℃30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。RASSF1A基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果判讀：甲基化引物未見(jiàn)條帶、非甲基化引物見(jiàn)條帶為未甲基化，其余為甲基化，甲基化陽(yáng)性率（%）＝（甲基化陽(yáng)性數(shù)／總例數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌RASSF1A基因啟動(dòng)子的甲基化變化 胃癌患者200例癌組織中檢測(cè)到74例RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，陽(yáng)性率為37.0%；對(duì)照患者30例正常胃壁組織中檢測(cè)到4例RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，陽(yáng)性率為13.3%，RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率在胃癌組織顯著高于正常胃壁組織（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的MSP-PCR 檢測(cè)

2.2 胃癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化變化與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 將胃癌患者根據(jù)腫瘤臨床分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度進(jìn)行分組，結(jié)果顯示胃癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率在臨床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和中、低分化的患者分別為46.2%、47.7%和48.7%，顯著高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高分化患者的27.1%、28.6%和29.8%（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 胃癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化變化與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 患者隨訪情況 術(shù)后隨訪1年，74例RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化胃癌患者復(fù)發(fā)12例，復(fù)發(fā)率為16.2%，對(duì)照患者復(fù)發(fā)7例，復(fù)發(fā)率為5.6%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

表觀遺傳學(xué)是指細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中DNA序列不改變，但一系列的DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等的參與，影響相關(guān)基因表達(dá)的一門學(xué)科［3-5］。其中，DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)中的一個(gè)重要內(nèi)容最受重視，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后評(píng)估的價(jià)值已經(jīng)得到了證實(shí)［6-7］。DNA甲基化機(jī)制是S-腺苷甲硫氨酸上的活性甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下的化學(xué)修飾過(guò)程，轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5 位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，因此可以設(shè)計(jì)特異性的引物區(qū)分出甲基化的狀態(tài)［8-9］，使用甲基化的特異性引物。本研究發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照正常胃壁組織，說(shuō)明RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化參與了胃癌的致病過(guò)程。RASSF1A基因是一個(gè)抑癌基因，可以通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，例如其可以阻斷JNK通路，下調(diào)細(xì)胞周期素1 等抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，DNA甲基化在調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用，抑癌基因啟動(dòng)子Cp G島的甲基化，可以失活相應(yīng)基因的表達(dá)［10-13］。由此可以間接推斷出RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化可以失活RASSF1A基因，參與胃癌的發(fā)生過(guò)程。

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，本研究觀察到胃癌患者RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率在臨床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和中、低分化的患者顯著高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高分化的患者。得出RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。

綜上所述，本研究顯示胃癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化，可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并有可能作為胃癌分級(jí)、預(yù)后評(píng)估的新指標(biāo)。由于本研究未檢測(cè)RASSF1A基因的表達(dá)情況，其啟動(dòng)子甲基化是否真正影響基因表達(dá)尚無(wú)直接的證據(jù)，具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證明。此外，DNA甲基化是一種可逆的變化，目前，已有5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-Cd R）去甲基化處理治療惡性腫瘤的報(bào)道［14-15］，針對(duì)RASSF1A基因啟動(dòng)子的去甲基化治療，有可能成為胃癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，相關(guān)方面的研究將會(huì)對(duì)腫瘤的治療和預(yù)后發(fā)揮積極的作用。

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