陳冬

摘 要：

[目的]建立一個同時測定人血漿中煙酸及其活性代謝物煙尿酸的RP-HPLC方法，并用于臨床藥代動力學(xué)研究。[方法]取1ml人血漿于一干凈試管中，加入20μl內(nèi)標(biāo)甲硝唑，渦旋10s，再加入3ml乙腈，渦旋1min，3000rpm下離心5min，將上清全部取出置于另一干凈試管，加入3ml氯仿，渦旋5min，3000rpm下離心5min，取水溶層（上層）200μl和100μl流動相混勻，取20μl進樣，檢測波長為262nm。[結(jié)果]煙酸，煙尿酸和內(nèi)標(biāo)甲硝唑的保留時間為4.5min，7.5min和105min。煙酸和煙尿酸日內(nèi)與日間精密度的RSD均小于11%，煙酸和煙尿酸在50ng/ml到5000ng/ml范圍內(nèi)線性均良好，煙酸的其他代謝物如煙酰胺、N-甲基煙酰胺等無干擾。

關(guān)鍵詞：

煙酸和煙尿酸;色譜法;高效液相;血樣處

中圖分類號：

TB

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-3198（2014）24-0225-03

煙酸為B族維生素之一，對人類和動物的營養(yǎng)有著重要的作用。很多文獻都報道了煙酸在脂代謝中的藥理作用和煙酸在治療高脂血癥中的廣泛應(yīng)用，但關(guān)于煙酸及其代謝產(chǎn)物的藥動學(xué)研究卻鮮有報道，在國內(nèi)同時測定煙酸和煙尿酸的方法還未見報道。為更好地研究煙酸降血脂作用和副作用的機制，建立一個簡便快捷準確測量生物樣品中煙酸及其代謝產(chǎn)物濃度的方法是很有意義和非常必要的。

在煙酸測定初級階段，一系列技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，如微生物法、色度法、傳統(tǒng)柱色譜法、氣液色譜法等，在過去的20年里，高效液相色譜法得到了普遍應(yīng)用。本法即在前人基礎(chǔ)上用高效液相色譜法測定人血漿中煙酸及其活性代謝產(chǎn)物煙尿酸的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)（Waters 600泵，Waters 2487型紫外檢測器，N2000型色譜工作站）;AUW120 D電子分析天平;臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;IKA VORTEX Genious 3渦旋器。

1.2 藥品與試劑

煙酸為原料藥;煙尿酸標(biāo)準品純度為99.9%，批號為20081101;甲醇為色譜純（天津市四友生物技術(shù)有限公司）;水為液相用水;其它試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Plastil ODS C18柱（150mm×4.6mm，5μm）;流動相：甲醇：5mmol/L己烷磺酸鈉：冰醋酸（12∶100∶1.2）;流速：1.0ml/min;

檢測波長：262nm;靈敏度：0.01AUFS;進樣量：20μl;柱溫：常溫。

2.2 標(biāo)準溶液的配制

（1）煙酸標(biāo)準溶液的配制：密稱定煙酸標(biāo)準品1005mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml煙酸標(biāo)準溶液。（2）煙尿酸標(biāo)準溶液的配制：精密稱定煙尿酸標(biāo)準品10.02mg，倒入10ml容量瓶中，用液相水定容，得1mg/ml煙尿酸標(biāo)準溶液。（3）煙酸、煙尿酸混合溶液的配制：1mg/ml的煙酸與煙尿酸標(biāo)準溶液各取2.5ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得250μg/ml混合溶液。

2.3 不同濃度煙酸與煙尿酸混合液的配制

（1）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲備液各取1ml，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得100μg/ml混合溶液;（2）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲備液各取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得50μg/ml混合溶液;（3）1mg/ml的煙酸與煙尿酸儲備液各取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得20μg/ml混合溶液;（4）100μg/ml的煙酸煙尿酸混合溶液取500μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得5μg/ml混合溶液;（5）100μg/ml的煙酸煙尿酸標(biāo)準溶液取200μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得2μg/ml混合溶液;（6）100μg/ml的煙酸煙尿酸混合溶液取100μl，加至10ml容量瓶中，液相水定容，得1μg/ml混合溶液。

2.4 QC血漿的制備

（1）取空白血漿9ml，加入10μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度0.1μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC1血漿;（2）取空白血漿9ml，加入100μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度1.0μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC2血漿;（3）取空白血漿9ml，加入250μg/ml的混合溶液90μl，劇烈渦旋10min，得血藥濃度2.5μg/ml的質(zhì)控血漿，即QC3血漿。

2.5 樣品處理

（1）取人血漿1ml，加入30μl純磷酸酸化，再加入500μg/ml的甲硝唑內(nèi)標(biāo)溶液20μl，渦旋10s;（2）加入3ml乙腈，渦旋1min，3000rpm下離心5min;（3）將上清液全部取出，置于另一干凈試管中，加入3ml氯仿，渦旋5min，3000rpm離心5min;（4）取水溶層200μl，加入100μl流動相，混勻進樣20μl即可。

2.6 試驗血漿的制備

精密量取人血漿1ml，分別加入煙酸和煙尿酸混合溶液1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml各50μl，使二者的濃度分別為0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml，按“樣品處理”方法處理后測定。

2.7 回收率試驗

取空白血漿1ml，加入液相水70μl（注：標(biāo)準溶液50μl和內(nèi)標(biāo)溶液20μl），按“樣品處理”方法處理，取出水溶層70μl，而后分別加入低、中、高2μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的混合溶液50μl，再加入20μl內(nèi)標(biāo)溶液，小心攪勻后進樣。一個濃度配制4份，分別進樣，每次的峰面積與當(dāng)天精密度實驗中的相應(yīng)峰面積平均值的比值，即為回收率。

2.8 數(shù)據(jù)處理

（1）用峰面積標(biāo)準曲線法計算血樣中尿酸濃度;（2）以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對血漿藥物濃度進行回歸，分別求出煙酸和煙尿酸各自的標(biāo)準曲線。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為

在本實驗條件下，煙酸、煙尿酸和內(nèi)標(biāo)分離良好，保留時間分別為4.5min、7.5min、10.5min。（圖1、圖2）

3.2 標(biāo)準曲線

以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對血漿藥物濃度進行回歸，分別求出煙酸（圖3）和煙尿酸（圖4）各自的標(biāo)準曲線。

圖3 煙酸標(biāo)準曲線

圖3 煙尿酸標(biāo)準曲線

3.3 實驗方法專屬性

取六種不同來源的人空白血漿1ml，按“樣品處理”方法處理后進樣，觀察內(nèi)源物質(zhì)的出峰情況，在本實驗條件下，煙酸，煙尿酸和內(nèi)標(biāo)有較大的色譜峰和較好的分離度，血漿中雜質(zhì)基本不干擾。

3.4 日內(nèi)、日間精密度

將低、中、高3個濃度（0.1，1.0，2.5μg/ml）的血漿樣品按“樣品處理”方法操作，分別在同1天內(nèi)測定6次和每天測定1次連續(xù)3天，計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果如表1、表2所示，精密度均較好。

表1 煙酸日內(nèi)、日間精密度

濃度日內(nèi)日間

（μg/ml）濃度（μg/ml）RSD（%）濃度（μg/ml）RSD（%）

0.10.0947、0.0909

0.1069、0.0945

0.0997、0.0960

5.70.1011

0.0971

0.1173

10.2

1.00.9960、1.0936

1.0110、0.9187

1.0198、0.9897

5.61.0830

1.0048

0.9835

5.1

2.52.4753、2.1655

2.1515、2.2656

2.2948、2.2597

5.12.4745

2.5420

2.3165

4.7

表2 煙尿酸日內(nèi)、日間精密度

濃度日內(nèi)日間

（μg/ml）濃度（μg/ml）RSD（%）濃度（μg/ml）RSD（%）

0.10.1120、0.1073

0.1107、0.1017

0.1006、0.0991

5.20.1070

0.1125

0.1051

3.6

1.00.9207、0.9854

1.0662、0.9707

0.9228、0.9188

6.01.1159

0.9641

1.0736

7.5

2.52.2379、2.3250

2.1941、2.3055

2.2990、2.2843

2.22.4007

2.2743

2.3801

2.9

回收率實驗結(jié)果（如表3、表4）。

表3 煙酸的回收率

濃度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1

85.5

87.5

87.3

93.9

88.5

4.18

1.0

104.7

106.3

111.2

110.9

108.3

3.02

2.5

99.9

103.5

103.4

97.8

101.2

2.77

表4 煙尿酸的回收率

濃度回收率（%）均值（%）RSD（%）

（μg/ml）1234

0.1109.1

115.1

119.1

118.1

115.3

3.92

1.0

113.1

116.0

115.8

115.9

115.2

1.21

2.5

99.9

104.3

103.2

101.1

102.1

1.95

4 討論

4.1 實驗干擾

煙酸為B族維生素之一，為正常人體不可或缺的微量物質(zhì)，正常人體血漿中即有內(nèi)源性的煙酸，對本實驗中煙酸峰的測定有一定干擾，故在實驗中應(yīng)扣除煙酸的內(nèi)源性本底。但通過專屬性實驗發(fā)現(xiàn)6種不同來源中內(nèi)源性煙酸的濃度均低于50ng/ml，對實驗干擾小，可以忽略不計。

4.2 色譜條件

流動相選擇：實驗初期，體外測定煙酸和煙尿酸時，用甲醇∶10mmol/L磷酸二氫鈉（4∶100，磷酸調(diào)pH值）作流動相也有很好的分離效果，但在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)由于流動相有機相比例過低，對煙酸峰有很大干擾。故最后采用甲醇∶5mmol/L己烷磺酸鈉∶冰醋酸（12∶100∶1.2）作為流動相，結(jié)果表明，樣品的峰形對稱，保留時間適宜。

4.3 血樣處理

（1）蛋白沉淀劑。實驗中曾用過直接用丙酮沉淀蛋白后進樣，發(fā)現(xiàn)有高濃度雜質(zhì)干擾，故不用。之后選擇用乙腈沉淀蛋白，效果好，干擾少。（2）調(diào)節(jié)pH值?；仡櫿麄€實驗，血樣處理時調(diào)節(jié)pH值是至關(guān)重要的一步，詳見下文“pH值的影響”分析。

4.4 煙酸和煙尿酸的性質(zhì)對實驗方法選擇的影響

（1）水溶性。

煙酸和煙尿酸的水溶性強，有機溶媒無法將藥物從血漿中提取出來，故液液萃取不能得到滿意效果。本實驗現(xiàn)用乙腈沉淀蛋白，將上清全部取出，再用氯仿反提，取水溶層（即上層）進樣。用氯仿反提不僅去除了部分干擾，而且有起到了濃縮，提高靈敏度的作用。

（2）酸性。

煙酸和煙尿酸均為弱酸性物質(zhì)，易與血漿中存在的堿性物質(zhì)結(jié)合，故血漿處理過程中應(yīng)加一定量酸酸化血漿。同時，二者對酸度非常敏感，響應(yīng)值、保留時間以及峰形都受酸度的影響。在“pH值的影響”一項中詳細講解。

4.5 pH值的影響

（1）流動相pH值。

實驗發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，煙酸和煙尿酸的響應(yīng)值隨著pH值的降低而升高，并且pH值的變化對二者的保留時間和峰形也有影響。考慮到pH值過低對色譜住的損壞，本實驗流動相pH值在3.0和3.2之間。

（2）酸對血漿處理的影響。

本實驗在血漿預(yù)處理中有兩步調(diào)節(jié)酸度的步驟。

第一步：加乙腈前用磷酸酸化血漿，實驗初未加磷酸酸化時，煙酸峰被掩蓋，煙尿酸峰良好但響應(yīng)值極低。之后采用100%，75%，50%和25%的磷酸酸化，響應(yīng)值差別不大，但100%峰形稍好。

第二步：進樣前水溶層與定量流動相混勻。實驗初不加流動相直接進樣，二者均出現(xiàn)肩峰。之后各取水溶層300μl，200μl，100μl與100μl流動相混勻進樣觀察，發(fā)現(xiàn)取200μl與100μl流動相混勻峰形較好。

5 結(jié)論

本方法血樣處理簡便，重現(xiàn)性好，可用于煙酸和煙尿酸在體內(nèi)的藥動學(xué)研究。

參考文獻

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