李琳琳，曹新志，游見明，趙迎慶

（四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

絲素蛋白中含有豐富的氨基酸，具有優(yōu)良的生物活性。但是由于絲素蛋白本身分子量較大，又不溶于水，所以其用途受到很大的限制。最新消化理論證明，一定分子量的多肽可以直接被消化道吸收，且轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，耗能較低同時(shí)還具有不易飽和的優(yōu)點(diǎn)，大大提高了蛋白的利用率[1]。作為高分子蛋白質(zhì)的沉淀劑，在沉淀劑使用量都過量的情況下，單寧酸能沉淀比磺基水楊酸和三氯乙酸更小的高分子蛋白質(zhì)，有文獻(xiàn)報(bào)道單寧酸能沉淀分子量為2 300 U 的蛋白質(zhì)，此外大分子蛋白質(zhì)與單寧酸溶液混合后立即產(chǎn)生沉淀[2]。離心后的上清液中含有的蛋白質(zhì)稱為酸溶性蛋白質(zhì)，只包括游離氨基酸和多肽，測定酸溶蛋白質(zhì)的總氮，扣除其中的游離氨基酸，即為多肽的含量。所以通過加入單寧酸可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子多肽分離，且速度較快，節(jié)省測定時(shí)間，提高效率。本試驗(yàn)采用單寧酸作為大分子蛋白質(zhì)的沉淀劑，結(jié)合茚三酮顯色法[3-4]和凱氏定氮儀[5-7]測定蠶絲蛋白水解液中多肽的得率。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及設(shè)備

HR-500 半自動(dòng)凱氏定氮儀：上海華睿儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16LG-B 冷凍離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司；H01-1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；PHS-2C精密pH 計(jì)：上海虹益儀器儀表有限公司。

1.2 試劑及其配制

pH 為5.4～5.6 的乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱取乙酸鈉30.0 g 加1.0 mL 冰醋酸進(jìn)行溶解，并加水稀釋至250 mL，混勻，用精密pH 計(jì)測量混合緩沖液的pH，若有偏差，微調(diào)并標(biāo)定至所需pH；3%茚三酮乙醇溶液：稱取1.5 g 茚三酮，加入適量乙醇微熱溶解后，轉(zhuǎn)移至500 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，置于4 ℃冰箱中備用；丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.010 0 g丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL 容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，搖勻，置于4 ℃冰箱中備用，此溶液濃度即為100 μg/mL；0.2%抗壞血酸的配制：準(zhǔn)確稱取0.2 g 抗壞血酸，加入適量去離子水進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度；40%NaOH 溶液的配制：準(zhǔn)確稱取400 g NaOH，加入適量去離子水進(jìn)行溶解，待NaOH 完全溶解并不斷攪拌使其無色透明時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度；4%硼酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取40 g 硼酸，加入適量去離子水并將其放在40 ℃～50 ℃的水浴鍋中進(jìn)行溶解，待其完全溶解至溶液變成無色透明時(shí)轉(zhuǎn)移至1 000 mL 容量瓶中，用去離子水定容至刻度；0.01 mol/L鹽酸的配制：準(zhǔn)確量取0.45 mL 鹽酸，緩慢注入500 mL水中。（此鹽酸溶液需進(jìn)行標(biāo)定）；15%單寧酸溶液的配制：準(zhǔn)確稱取15 g 單寧酸，加適量水溶解，然后用容量瓶定容至100 mL；混合指示劑：0.1%甲基紅乙醇溶液和0.5%溴甲酚綠乙醇溶液等體積混合?；旌洗呋瘎?.2 g～0.3 g 的硫酸鉀與0.2 g～0.3 g 的五水硫酸銅混合均勻。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確抽取3.0 mL 購買的樣品液，經(jīng)離心機(jī)4000r/min離心10 min，吸取上清液1.0 mL 注入比色管中，再加入15%的單寧酸3 mL，室溫靜置沉淀10 min，用離心機(jī)4 000 r/min 離心30 min。

1.4 上清液中游離氨基酸的含量

準(zhǔn)確量取1.3 中的上清液1.0 mL 置于25 mL 比色管中，加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加水至25 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，在568 nm 波長下比色，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的游離氨基酸含量。

1.5 上清液中多肽含量的測定

準(zhǔn)確移取1.3 中的上清液2.0 mL 加入消化管中，之后依次加入0.5 g 混合催化劑、98%的濃硫酸10 mL，打開消化爐，待消化爐的溫度升到421 ℃時(shí)計(jì)時(shí)開始，讓其消化1.0 h 后，關(guān)閉消化爐，冷卻至室溫。將消化管放入凱氏定氮儀，關(guān)上安全門，等待儀器蒸餾，蒸餾結(jié)束，取出消化管和收集氨氣的錐形瓶，之后用0.01%的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定，錐形瓶里的液體溶液由藍(lán)綠色變?yōu)槲⒓t色時(shí)為滴定終點(diǎn)。記錄鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積，同時(shí)測定空白值。

1.6 上清液中多肽含量的計(jì)算

式中：W 為蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，（g/100 mL）；C 為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，（mol/L）；V1為空白滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；V2為樣品消耗滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，mL；2 為取蠶絲水解液樣品的體積，mL；M氮為氮的摩爾質(zhì)量14.01g/mol；6.25 為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

式中：T 為多肽的含量；A 為游離氨基酸的含量。

同一樣品測定3 次，其結(jié)果的算數(shù)平均值作為最終結(jié)果，最終結(jié)果精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的條件選擇

2.1.1 反應(yīng)原理

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)外，其他所有的α-氨基酸都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)[8]。該反應(yīng)分兩步進(jìn)行，首先是氨基酸被氧化，產(chǎn)生CO2、NH3和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成的還原型茚三酮與另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5.0～7.0，同一濃度的氨基酸在不同pH 條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色，因此要控制好pH。該反應(yīng)十分靈敏，1 ∶1 500 000 濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應(yīng)，因此是一種常用的氨基酸定量方法。

2.1.2 波長條件的選擇

分別取丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液、樣品溶液、去離子水各1 mL于3 支試管中，甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液重復(fù)做3 次。然后在各試管中依次加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL抗壞血酸溶液，3.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，搖勻，置于沸水浴中加熱20 min，取出，冷卻。以去離子水為空白，在分光光度計(jì)中進(jìn)行波長掃描，測定丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液、樣品溶液的吸光度值。結(jié)果表明對照品溶液和樣品溶液在569 nm 處均有最大的吸收，因此確定本試驗(yàn)的最佳測定波長為569 nm。

2.1.3 茚三酮加入量的選擇

在6 根25 mL 比色管中分別加入5.0 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后在6 支比色管中依次加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 茚三酮溶液，再分別加入2.0 mL 抗壞血酸溶液和5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗(yàn)。在569 nm 波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖1。

由圖1 可知，當(dāng)茚三酮加入量在1.0 mL～3.5 mL時(shí)，隨著茚三酮加入量的不斷增大，吸光度不斷增大，當(dāng)茚三酮用量為2.0 mL 時(shí)接近最大值，故茚三酮的加入量以2.0 mL 為宜。

圖1 茚三酮用量對吸光度的影響Fig.1 The effect of amount of ninhydrin on Absorbance

2.1.4 抗壞血酸溶液加入量的選擇

在6 根25 mL 比色管中分別加入5 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，然后在6 支比色管中分別加入2.0 mL 茚三酮溶液和5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，再依次加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 抗壞血酸溶液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗(yàn)。在569 nm 波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖2。

圖2 抗壞血酸用量對吸光度的影響Fig.2 The effect of amount of ascorbic acid on Absorbance

由圖2 可知，當(dāng)抗壞血酸加入量在1.0 mL～3.5 mL時(shí)，隨著抗壞血酸加入量的不斷增大，吸光度不斷增大，當(dāng)抗壞血酸用量為2.0 mL 時(shí)接近最大值，故抗壞血酸的加入量以2.0 mL 為宜。

2.1.5 顯色時(shí)間的選擇

在6 根25 mL 比色管中依次分別加入5 mL 丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液，加水定容至刻度，搖勻。置于沸水浴中分別加熱10、15、20、25、30 min 進(jìn)行顯色，取下冷卻，定容，以去離子水為空白試驗(yàn)。在569 nm波長下測定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，結(jié)果見下圖3。

圖3 顯色時(shí)間對吸光度的影響Fig.3 The effect of chromogenic time on Absorbance

由圖3 可知，顯色時(shí)間在10min～30min 之間時(shí)，開始時(shí)隨著顯色時(shí)間的延長吸光度不斷增大，到20 min時(shí)顯色時(shí)間達(dá)到最大，繼續(xù)延長顯色時(shí)間，吸光度基本保持在20 min 時(shí)的水平，因此，顯色時(shí)間以20 min為宜。

2.1.6 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[9-10]

在6 支25mL 的比色管中分別加入0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 的丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別加入2.0 mL 茚三酮溶液，2.0 mL 抗壞血酸溶液，5.0 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，加水至25 mL，搖勻。置于沸水浴中加熱20 min 進(jìn)行顯色取下冷卻，定容。用紫外分光光度計(jì)在569 nm 波長條件下，于3 cm 比色皿中以試劑空白做對照，測定標(biāo)樣顯色溶液的吸光度。以丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖4。

圖4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Stanurd curve of Amino acid

由以上標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為y=0.033 5x-0.000 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，因此在氨基酸濃度在0～25 μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 單寧酸沉淀蛋白質(zhì)的條件的選擇[11-13]

本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)L9（34）對15%單寧酸沉淀蛋白質(zhì)的條件進(jìn)行選擇優(yōu)化，四個(gè)因素分別是體積比，離心時(shí)間，沉淀溫度和沉淀時(shí)間。正交試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3 和表4。

通過對正交試驗(yàn)結(jié)果的分析可知，對多肽得率影響最大的因素是樣液與單寧酸的體積比，其次是離心時(shí)間，而沉淀時(shí)間和沉淀溫度對多肽得率的影響都是比較小的，同時(shí)得到最優(yōu)方案為A2B2D1C1，即所選的最佳因素水平為樣液與單寧酸的體積比為1 ∶3，離心時(shí)間為30 min，沉淀時(shí)間為5 min，沉淀溫度為30 ℃。由于所選定的最優(yōu)方案不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，故而我們又進(jìn)一步對其進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下得出其多肽得率為87.89%，比正交試驗(yàn)表中的最佳方案A2B2D1C3所得的多肽得率86.17%高，故最終所選方案為A2B2D1C1。

表1 正交試驗(yàn)的因素水平表Table 1 Factor level charts of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)L9（34）的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and the results of orthogonal test L9（34）

表3 試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 3 Analysis of test results

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析（Fα=19.00，α=0.05）Table 4 Orthogonal test analysis of variance

3 結(jié)論

本試驗(yàn)探索了測定蠶絲多肽含量的方法條件，為蠶絲蛋白水解液中多肽含量的測定提供更有效的方法。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果也證明了15%單寧酸對大分子蛋白質(zhì)的沉淀時(shí)間相比較于三氯乙酸以及磺基水楊酸是很快的，其反應(yīng)時(shí)間幾乎是在瞬間就完成的，故而用單寧酸可以節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，提高試驗(yàn)效率，增加效益。

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