（金華市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測院，浙江金華321000）

目前大多數(shù)獸藥殘留分析采用了HPLC法，但HPLC至今仍缺少可滿足獸藥殘留分析要求的通用型檢測器。HPLC—EC和HPLC—MS法樣品前處理簡單[1-2]，選擇性好，靈敏度高，現(xiàn)在一般地區(qū)級以上的檢測部門均已配備HPLC-MS/MS，然而作為食品中阿奇霉素殘留測定的標(biāo)準(zhǔn)卻仍未建立，本文參考國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上[3-6]，首次建立高效液相——質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）法測定雞可食組織中阿奇霉素的殘留，為保證動物源性食品安全提供一種快捷、靈敏、可靠、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，也為藥物在家禽體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究提供定量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗與儀器

阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)品，50 mg，97.0%，20℃保存，德國dr.ehrenstorfer公司，由上海安譜科學(xué)儀器有限公司代購；所用試劑除乙腈、甲醇為色譜純，除水為超純水外其余均為國產(chǎn)分析純。

液質(zhì)聯(lián)用儀LC、1200 DAD和6410B QQQ質(zhì)譜檢測器：美國Agilent1200公司；色譜柱XDB-C18，1.8μm，2.1×100 mm：美國Agilent公司；高速冷凍離心機(jī)，BIOFUGE STRATOS：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

精密稱取雞可食組織2.0 g樣品磨碎，加入勻漿介質(zhì)磷酸鹽緩沖液（pH7.5）4 g，勻漿機(jī)5 000 r/min勻漿10 min，制成勻漿組織液；準(zhǔn)確稱取1.5 g勻漿組織液（相當(dāng)于0.5 g雞可食組織）于10 mL離心管中，再加0.5 mol/L氫氧化鈉溶液100 μL，旋渦震蕩2 min，加含5%異丙醇的氯仿4 mL，旋渦震蕩萃取10 min，離心（10 000 r/min）5 min， 精密量取有機(jī)層2.0 mL，45℃水浴氮?dú)饬鞔蹈?，加流動?00 μL渦旋2 min，4 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm濾膜過濾，超聲波清洗器中超聲20 min，取5 μL進(jìn)樣HPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18， 1.8 μm，2.1×30 mm；檢測器：Agilent 1200 DAD檢測器；流動相：A：60%水（0.1%甲酸），40%甲醇；流量：0.4mL/min；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：25℃；檢測波長：195 nm。

1.2.3 肉雞組織標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取1.5 g勻漿液（相當(dāng)于雞可食組織0.5 g）于10 mL離心管中，加入阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使組織中阿奇霉素濃度分別為 0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.4、0.8、1.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)組織樣品。旋渦震蕩10 min。后續(xù)操作同樣品處理方法。

1.2.4 組織加標(biāo)回收率測定

取空自雞肉組織樣品，加阿奇霉素工作液配制成0.05、0.10、0.50 μg/g 3 個水平的雞肉樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法處理后進(jìn)行測定，同時將對應(yīng)3個水平的阿奇霉素用流動相溶解作HPLC-MS/MS分析，每個樣品均重復(fù)5次，以峰度比定性，按定量離子峰面積定量來求得藥物回收率。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗

按組織加標(biāo)回收率方法制得0.05、0.10、0.50 μg/mL（或μg/g）3個水平的阿奇霉素濃度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法，每個批次作8個重復(fù)，共作5個批次，測得實(shí)際濃度，求出每個濃度的批內(nèi)和批間變異系數(shù)（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜結(jié)果

在阿奇霉素液質(zhì)聯(lián)用參數(shù)研究選定的優(yōu)化色譜條件下，阿奇霉素保留時間在1.2 min～1.4 min之間，添加標(biāo)準(zhǔn)品的樣品色譜峰峰形較佳，為基線分離峰。

優(yōu)化后，質(zhì)譜的相關(guān)色譜條件為a）電離方式：電噴霧電離，正離子；b）離子噴霧電壓：400 V；c）霧化氣：氮?dú)猓?5 psi；d） 干燥氣： 氮?dú)猓?流速11 L/min， 溫度350℃；e）碰撞器：氮?dú)?；f）掃描模式：MRM，母離子 m/z 749.5，定量離子 m/z589.5，定性離子 m/z157.8；g）駐留時間：200 ms；h） 裂解電壓 160 V；i） 碰撞能量：m/z 749.5＞589.5為20 V，m/z749.5＞157.8為20 V。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢測限

圖1 阿奇霉素標(biāo)準(zhǔn)液總離子流、特征離子峰度Fig.1 Azithromycin standard solution total ion current，characteristic ion peaks

雞肉組織中的阿奇霉素工作液在選定的色譜條件下用HPLC-MS/MS測定，以出現(xiàn)藥物峰的最低組織藥物濃度作為判定藥物在組織中的最低檢測限。標(biāo)準(zhǔn)濃度在0.001 μg/mL時，生雞蛋加標(biāo)在1.231 min處出現(xiàn)一小峰，可作為最低檢測限（LOD）。當(dāng)加標(biāo)后最終藥物濃度在低濃度范圍 0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 與高濃度范圍 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL 內(nèi)，縱軸色譜峰面積（S），與橫軸各濃度（C）分別呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，得到各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，阿奇霉素的最低定量限（LOQ）0.5 pg/mL，制備相關(guān)數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1、表2，圖2、圖3。

圖2 阿奇霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線（高濃度加標(biāo)區(qū)間）Fig.2 Preparation of azithromycin curves（high concentration standard interval）

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（低濃度加標(biāo)區(qū)間）Table 2 Preparation of standard curves（low concentration standard interval）

圖3 阿奇霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線（低濃度加標(biāo)區(qū)間）Fig.3 Preparation of azithromycin curves（low concentration standard interval）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 回收率試驗

在選定的HPLC MS/MS測定條件下，雞可食組織的相對回收率見表3。

由表 3可知， 生雞蛋在 0.05、0.20、0.50 μg/g添加水平時，分別是 78.86±2.87，83.26±2.72，87.12±2.15，回收率水平依次為生雞蛋，生雞肌肉，半熟雞肉，雞肉最低分別為 73.76±3.53，74.60±3.45，78.56±2.84。

表3 雞可食組織中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 3 Chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗

日內(nèi)和日間的變異系數(shù)（RSD）見表4、表5。

表4 日間雞可食組織中阿奇霉素的回收率（n=5，%）Table 4 Within-day chicken edible organizations of azithromycin in the recovery rate（n=5， %）

表5 雞可食組織中日內(nèi)和日間變異系數(shù)（n=5，%）Table 5 Chicken edible tissues within-day and between-day coefficient of variation（n=5， %）

由表知，生雞蛋和生雞肌肉的日間變異系數(shù)均大于日內(nèi)的變異系數(shù)，而半熟雞肉的日間與日內(nèi)變異系數(shù)無規(guī)律；此外隨著藥物濃度的增加，各組織的變異系數(shù)普遍存在逐漸變小的趨勢，表明穩(wěn)定性與藥物濃度存在正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論

本研究所得HPLC-MS/MS法檢測阿奇霉素的主要色譜條件為：XDB-C18色譜柱（1.8 μm，2.1×30 mm）；以0.1%甲酸的水和甲醇（60∶40，體積比）作為流動相；流量為0.4mL/min；以MRM掃描模式，母離子m/z 749.5，定量離子m/z 589.5，定性離子m/z 157.8進(jìn)行檢測。確定0.001μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)濃度為最低檢測限（LOD），阿奇霉素組織在添加濃度為0.04 μg/g～0.80 μg/g 與0.80 μg/g～4.0 μg/g（相當(dāng)于加標(biāo)后進(jìn)樣濃度0.01 μg/mL～0.20 μg/mL 與 0.20 μg/mL～1.0 μg/mL）范圍時，濃度與峰面積呈線性相關(guān)。采用本法測定雞可食組織中阿奇霉素回收率在73.6%以上，日內(nèi)日間變異系數(shù)均小于5%。結(jié)果還表明肉雞可食組織中添加藥物濃度越高，變異系數(shù)越小，穩(wěn)定性越好。本方法前處理簡單，出峰時間短，簡單快速，檢出限低，符合動物性食品中阿奇霉素殘留量監(jiān)控的需求。