王人悅，杜蘇萌

（1．天津市食品研究所有限公司，天津301609；2.太原工業(yè)學院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008）

固定化細胞技術是70年代以后迅速發(fā)展起來的一項生物技術，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛地應用于發(fā)酵工業(yè)、食品工業(yè)、化學分析、醫(yī)藥工業(yè)等領域，并顯示其優(yōu)越性.近年來，已經(jīng)有報道固定化酵母柱式反應器連續(xù)發(fā)酵，快速生產(chǎn)啤酒的文獻發(fā)表[1-2]。我國20 世紀80年代初期所建的啤酒廠均為分批式發(fā)酵池，對傳統(tǒng)設備和工藝進行改革，以達到提高設備利用率、縮短發(fā)酵周期、降低能耗，這也是一些傳統(tǒng)工藝啤酒生產(chǎn)廠家所亟待解決的一個問題[3-4]。

固定化細胞具有生長快、反應快、抗污染能力強、能夠連續(xù)使用、有利于產(chǎn)物分離的特點，逐漸廣泛地應用于食品與發(fā)酵工業(yè)中。應用固定化酵母細胞發(fā)酵生產(chǎn)啤酒，是當前啤酒生產(chǎn)工藝的重大改革和發(fā)展方向[5-6]。

酵母在固定化載體中增殖快，生長良好、具有較高的穩(wěn)定性，使用壽命可達兩個月[7-8]。海藻酸鹽是目前常用的固定化載體，本研究對游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒和固定化酵母發(fā)酵啤酒的特性進行研究對比，并使用不同濃度的海藻酸鈉與不同濃度的氯化鈣包埋酵母細胞發(fā)酵啤酒，通過測定發(fā)酵過程中總糖、還原糖、酒精度和雙乙酰的含量變化來研究了海藻酸鈉固定化酵母發(fā)酵啤酒的優(yōu)越性能。

1 材料與方法

1.1 麥芽、酵母及主要試劑

麥芽、酵母：濟南金源啤酒原料有限公司；海藻酸鈉、鄰苯二胺：天津光復精細化工研究所；氯化鈣：北京化工廠。

1.2 儀器

SPX-250B-D 生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；WMZK-72 恒溫水浴鍋：上海躍進醫(yī)療器械廠；LD5-2A 低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；SHA-C 水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；752N 紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總糖和還原糖測定

取兩個150 mL 錐形瓶，分別加入5.0 mL 菲林乙液，5.0 mL 甲液，并加水10 mL，用1%葡萄糖標準溶液先標定菲林試劑溶液，再在相同條件下，用樣品液滴定菲林試劑，按照以下公式：X（以葡萄糖計，%）=（C×v1×V）/（m×v2×1 000）×100，計算還原糖含量，式中：X 為樣品中還原糖的含量；C 為葡萄糖標準溶液的濃度，（mg/mL）；v1為滴定10 mL 菲林溶液時消耗葡萄糖標準溶液的體積，mL；V 為樣品定容體積，mL；m 為樣品質量，g；v2為測定時平均消耗樣品溶液的體積，mL。

1.3.2 酒精含量測定

用測定微量乙醇的方法，重鉻酸鉀氧化乙醇成為醋酸。

3CH3CH2OH+2K2Cr2O7+8H2SO4→3CH3COOH+2Cr2（SO4）3+2K2SO4+11H2O

氧化乙醇后剩余的重鉻酸鉀與碘化鉀作用，生成游離的碘。

K2Cr2O7+6KI+7H2SO4→4K2SO4+Cr2（SO4）3+7H2O+3I2

游離的碘再被硫代硫酸鈉還原，從而根據(jù)氧化乙醇所消耗的重鉻酸鉀量計算出乙醇含量。2Na2S2O3+I2→2NaI+Na2S4O6

1.3.3 雙乙酰含量測定

鄰苯二胺與雙乙酰反應生成2，3-二甲喹喔啉在335 nm 下有一最大吸收，可對雙乙酰進行定量測定。

1.3.4 酵母細胞的固定

稱取一定質量的活化酵母菌體，將菌體細胞加入2%～6%的海藻酸鈉溶液，充分混勻，然后用10 mL 注射器中，將海藻酸鈉菌懸液適度加力注入CaCl2溶液中（37 ℃水?。Ｗ⑼旰髮⑷瞧恳迫?0 ℃～22 ℃水浴中放置1 h。傾去溶液，加入100 mL 無菌去離子水沖洗1 次。重新加入50 mL 0.6%CaCl2溶液，4 ℃平衡過夜。

2 結果與分析

啤酒發(fā)酵中總糖變化見圖1。

圖1 啤酒發(fā)酵中總糖變化Fig.1 The variation of total sugar during beer fermentation

由圖1 可知用游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒比固定化酵母發(fā)酵麥汁中含總糖量高。

啤酒發(fā)酵中還原糖變化見圖2。

圖2 啤酒發(fā)酵中還原糖變化Fig.2 The variation of reducing sugar during beer fermentation

由圖2 可知用游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒比固定化酵母發(fā)酵麥汁中含還原糖量高。

啤酒發(fā)酵中酒精含量變化見圖3。

圖3 啤酒發(fā)酵中酒精含量變化Fig.3 The variation of alcohol during beer fermentation

由圖3 可知用固定化酵母發(fā)酵啤酒比游離態(tài)酵母發(fā)酵麥汁中酒精度含量高。

啤酒發(fā)酵中雙乙酰含量變化見圖4。

圖4 啤酒發(fā)酵中雙乙酰含量變化Fig.4 The variation of diacetly during deer fermentation

由圖4 可知用固定化酵母發(fā)酵啤酒比游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒時，雙乙酰含量提前達到最大值0.35 mg/mL。

固定化強度變化見圖5。

由圖5 可知使用4%的CaCl2固定酵母細胞時強度最好。

酒精量變化情況見圖6。

圖6 酒精量變化Fig.6 The variation in the amount of alcohol

由圖6 可知用2%海藻酸鈉與4%氯化鈣固定酵母細胞時酒精含量最高。

3 討論

傳統(tǒng)的游離酵母發(fā)酵啤酒周期需20 d～30 d，該研究用固定化酵母發(fā)酵啤酒周期為一個星期，生產(chǎn)周期大大縮短，固定化酵母發(fā)酵啤酒方法特別適合于夏季、秋季對啤酒需求旺盛的季節(jié)使用。圖1 和圖2 表明游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒過程中糖度降低慢于固定化酵母發(fā)酵啤酒，說明固定化酵母能夠更好轉化麥汁中的糖類，顯示出固定化優(yōu)勢。圖3 表明固定化酵母發(fā)酵啤酒在第5 天酒精含量達到最大值，而游離態(tài)酵母發(fā)酵啤酒在第7 天才達到最大值，說明固定化酵母發(fā)酵可以縮短發(fā)酵周期。圖4 表明固定化酵母對雙乙酰的轉化時間比游離態(tài)酵母對雙乙酰的轉化時間要短，固定化酵母相比游離態(tài)酵母確實可以縮短啤酒發(fā)酵周期，提高發(fā)酵效率。

海藻酸鈉是一種高分子天然凝膠包埋劑，常用于酵母及其他各種微生物的固定化，Ca2+是決定海藻酸鈉固定化菌體機械強度的重要因素，Ca2+濃度增加，固定化酵母的強度增加，較低的海藻酸鈉濃度使凝膠滲透性能好，有利于底物和產(chǎn)物進出，從而促進酵母的發(fā)酵代謝[9]，圖5 和圖6 表明選擇2%海藻酸鈉與4%氯化鈣時固定細胞酵母強度最大，酒精含量最高，Ca2+濃度提高有助于固定化酵母細胞的機械強度，這與文獻報道的結果一致。

[1] 薛亮,黃祖新,羅招城,等.海藻酸鈉-PVA 固定化釀酒酵母制備工藝的優(yōu)化[J].釀酒科技,2009(2):27-30

[2] 楊文娟,朱敏莉,齊智濤,等.殼聚糖/海藻酸鹽微膠囊固定化釀酒酵母生產(chǎn)乙醇[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(8):25-29

[3] 武運,楊海燕.固定化酵母發(fā)酵蟠桃酒的工藝研究[J].釀酒,2008,35(1):102-105

[4] Zengran Liu, Guangyi Zhang, Yunping Sun. Mutagenizing Brewing Yeast Strain for ImprovingFermentation Property of Beer[J]. Journal of bioscience and bioengineering,2008,106(1):33-38

[5] 李娜,李樹立,郭忠鵬.固定化酵母細胞發(fā)酵啤酒的初步研究[J].China brewing,2007(9):174-175

[6] 呂欣,李永飛,段作營,等.固定化酵母研究進展[J].IQUOR MAKING,2002(29):43-46

[7] Isono Yasuyuki,Araya Cen-ichiro,Hoshino Akiro.Immobilization of saocharomyces cerevisinc for ethanol fermerstationong -ahumina particles using a spray-dryer[J]. Process Biochen,1995,30(8):743-746

[8] Converti A.Modeling of contirnrous com sturch hydrolyzate fermentations in immobilized-cell reactors[J].Starch,1994,46(7):260-265

[9] Sommariva Corrado,Converti Attilia,Bocghi Ferradolo Giuseppe.A theoretical to the evaluation of the effectivenss factor in an entrapped yeast cell colum[J].Chem Eng J,1992,49(2):23-28