湯明明 潘玉芹 林文娟

(1中國科學院心理健康重點實驗室, 中國科學院心理研究所, 北京 100101)

(2中國科學院大學, 北京 100049)

1 引言

抑郁癥中伴有免疫功能異常的觀點提出已經(jīng)有20年, 但這些異常在抑郁癥的發(fā)病機理中如何發(fā)揮作用, 仍然沒有得到清晰闡釋(Maes et al.,2009; Miller, Maletic, & Raison, 2009)。在眾多研究中, 比較一致的發(fā)現(xiàn)是抑郁癥患者血漿中炎性細胞因子的水平升高, 包括IL-1β、IL-6、TNF-α以及IFN-γ等(Himmerich et al., 2008; Howren, Lamkin,& Suls, 2009; Schiepers, Wichers, & Maes, 2005)。全系統(tǒng)暴露于炎性刺激物, 例如革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分脂多糖, 不僅能夠誘發(fā)外周炎癥過程,也能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng), 表現(xiàn)為腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活并產(chǎn)生更多的前炎性細胞因子, 如IL-1β、IL-6和TNF-α等(Miller et al., 2009)。LPS引起的腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及升高的前炎性細胞因子, 可以誘導特異性癥狀, 稱為病態(tài)行為綜合征(Maes et al., 2012)。癥狀包括厭食、嗜睡、活動能力和探索能力下降、快感缺乏以及認知障礙等, 與抑郁癥有很強的相似性, 同時抑郁癥患者情緒癥狀與炎癥反應(yīng)的存在也具有很強的相關(guān)性(Dantzer,2009)。這些證據(jù)提示LPS誘發(fā)炎癥反應(yīng)并引起抑郁癥狀, 因此常用于建立免疫激活誘發(fā)抑郁樣行為的動物模型。

目前國際上的研究主要應(yīng)用外周LPS處理建立抑郁動物模型, 為探索炎癥反應(yīng)如何參與抑郁癥病理機制提供實驗依據(jù)(O'Connor et al., 2008; Qin et al., 2007)。但常見的外周LPS處理所引起的抑郁樣行為表現(xiàn)通常持續(xù)僅數(shù)小時, 少有超過24 h(Dantzer, 2004; Inoue, Somay, Poole, & Luheshi,2008; Silverman et al., 2013, Wang et al., 2011 )。例如單次腹腔注射LPS后2 h到8 h, 動物出現(xiàn)攝食下降、社會退縮、強迫游泳和懸尾不動時間增加等抑郁樣行為, 但到注射后24 h行為基本恢復正常水平(Frenois et al., 2007; Park, Lawson, Dantzer, Kelley,& McCusker, 2011; 池少鵬, 戚智, 姬廣聚, 鄺雪瑩,林文娟, 2012)。這些LPS注射后24 h內(nèi)出現(xiàn)的抑郁樣行為可能受到病態(tài)行為的干擾 (Dantzer,O'Connor, Freund, Johnson, & Kelley, 2008; Frenois et al., 2007; Maes et al., 2012)。而且LPS注射后2～4 h與24～48 h這兩個時段存在不同的神經(jīng)元激活機制(Frenois et al., 2007; O'Connor et al., 2009)。外周單次LPS處理的這種短效特點無法為有針對性地探索抑郁樣行為背后的神經(jīng)免疫機制提供適當?shù)膭游锬Ｐ? 限制了對炎性反應(yīng)誘發(fā)抑郁的病理機制的深入研究。因此迫切需要建立能夠誘發(fā)較長時程抑郁樣行為的免疫激活動物模型。

為克服單次外周LPS注射模型存在的上述不足, 一些研究者曾嘗試采用外周LPS重復注射的方法, 以期誘導持續(xù)時間更長的抑郁樣行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周LPS重復注射導致動物明顯藥物耐受, 并不能誘發(fā)顯著的抑郁樣行為(潘玉芹, 王東林, 林文娟, 2007)。與外周炎性免疫反應(yīng)相比, 中樞免疫激活引起的腦內(nèi)細胞因子水平變化更可能是抑郁樣行為產(chǎn)生的直接原因(Sharpley & Agnew, 2011)。從中樞途徑激活免疫炎性反應(yīng)可能是建立抑郁動物模型更為有效的手段。本工作由此假設(shè), 從中樞途徑注射LPS可能更有效、更穩(wěn)定地誘發(fā)達到甚至超過24 h的長時程抑郁樣行為。本實驗以大鼠為模型動物, 通過腦室立體定位注射LPS, 考察單次和重復注射后中樞免疫激活導致的行為改變以及行為改變的時程效應(yīng)。希望建立一種新的中樞炎性免疫誘發(fā)抑郁模型, 為研究抑郁癥炎性免疫機制提供更為可靠的動物模型。

2 實驗材料和方法

2.1 動物

實驗選用無特定病原體級(Specific pathogen free, SPF級)雄性Sprague-Dawley大鼠, 體重260～280g, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。所用動物飼養(yǎng)于12 h / 12 h晝夜周期(上午7:00開燈, 晚19:00關(guān)燈), 溫度22 ±1℃,濕度40～60%的環(huán)境中。單籠飼養(yǎng), 不銹鋼籠具25cm×22.5cm×30cm, 自由采食飲水。實驗開始前,每天抓取撫摸5 min, 維持7天, 使其適應(yīng)實驗室環(huán)境和實驗人員操作。實驗程序獲得中國科學院心理研究所倫理審查委員會批準, 并符合國家動物管理和使用規(guī)則。

2.2 手術(shù)和注射

適應(yīng)期過后, 對大鼠實施腦部立體定位手術(shù)。1%戊巴比妥鈉(Merck, Germany)溶液腹腔注射麻醉大鼠, 麻藥劑量為35 mg/Kg。將麻醉后的動物置于腦立體定位儀上(STOELTING, USA), 耳插固定。整個手術(shù)過程通過加熱墊(RWD Life Science Co.,Ltd, China)維持動物體溫在37℃。

依據(jù)注射藥物需要, 采用單側(cè)腦室插管。不銹鋼材質(zhì)植入導管(外徑0.64 mm, 長16 mm; RWD Life Science Co., Ltd, China)植入左側(cè)側(cè)腦室。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜(Paxinos & Watson, 2006)確定位置坐標為：前囟后0.9 mm, 外側(cè)1.1 mm, 顱骨表面下3.2 mm。在植入導管周圍擰入兩顆螺絲釘, 用丙烯酸樹脂將導管和螺絲釘固定在頭骨上。以阻塞內(nèi)管封閉植入導管, 防止異物進入引起導管堵塞。手術(shù)后在大鼠后腿肌肉注射抗生素(5萬單位青霉素鈉溶液, 0.25 ml), 防止術(shù)后感染。隨后將大鼠放回干凈的籠子, 恢復7天后再進行藥物注射和行為測試。

通過微量注射泵(HARVARD APPARATUS,USA)進行藥物注射。LPS (Sigma, USA)溶于無菌生理鹽水(山東齊都藥業(yè)有限公司)中, 配置成濃度為100 ng/ul的注射液。藥物注射劑量參考先前研究報道(Fu et al., 2010; Pan et al., 2013)。對照組注射等量無菌生理鹽水。注射前將注射內(nèi)管(外徑0.41 mm,插入后長度超過植入導管末端1 mm, RWD Life Science Co., Ltd, China)插入植入導管, 由微量注射泵將1 μl的LPS溶液或者生理鹽水以1 μl/min速度注射入側(cè)腦室。注射結(jié)束后停留注射內(nèi)管1 min以確保藥物足量擴散入側(cè)腦室。給藥時間為早上9：00, 隔日進行。

2.3 實驗程序

實驗一：腦室LPS單次、重復注射誘導大鼠抑郁樣行為。

為建立大鼠中樞炎性免疫激活抑郁模型, 本實驗嘗試單次腦室LPS注射和重復腦室LPS注射兩種方式。單次注射程序如圖1A所示, 在恢復期結(jié)束后, 向腦室注射一次LPS (或無菌生理鹽水), 注射后24 h進行糖水偏好、懸尾和曠場測試。重復注射程序如圖2A所示, 在恢復期后注射三次LPS或鹽水, 每次間隔48 h, 末次注射后24 h進行與單次程序中相同的行為測試。

實驗二：考察重復LPS腦室注射誘導大鼠抑郁樣行為的時程效應(yīng)。

根據(jù)實驗一結(jié)果, 進一步探索中樞炎性免疫激活抑郁模型中行為改變的時程效應(yīng)。流程如圖3A,恢復期后, 測量行為數(shù)據(jù)基線。注射程序結(jié)束后,選擇末次注藥后1天(24 h), 3天(72 h), 5天和7天時間點測量行為改變時程。以糖水偏好、曠場、懸尾測試等多個指標, 衡量腦室LPS重復注射誘導大鼠抑郁樣行為的時程效應(yīng)。

2.4 行為測試

糖水偏好：

糖水偏好用于評價實驗動物快感缺乏程度, 糖水消耗的下降是典型的抑郁樣行為(Wann, Audet, Gibb, & Anisman, 2010)。在正式測量前, 大鼠經(jīng)過4天的適應(yīng)訓練。訓練開始于手術(shù)恢復期后, 程序為每天12:00斷水, 20 h后, 即次日8:00適應(yīng)訓練4 h。訓練時同時給大鼠一瓶清水和一瓶0.5%的糖精鈉(天津北方食品有限公司)溶液。訓練前后給水瓶稱重, 以計算糖水和水的消耗量。糖水偏好用糖水消耗量(實驗一)或者糖水消耗和總液體消耗的比值(實驗二)表示。第4次適應(yīng)訓練后,撤掉糖水保留清水, 動物繼續(xù)自由飲水。正式測量糖水偏好, 程序為同時給予清水和糖精鈉溶液, 測量1 h (8:00～9:00)內(nèi)動物對糖水和水的消耗量。訓練和測試過程, 兩種水瓶的位置隨機擺放。

曠場測試：

糖水偏好測量結(jié)束后, 進行曠場測試。曠場測試用于評價動物的自發(fā)活動能力和探索行為能力, 能夠反映抑郁狀態(tài)下的活動能力下降(Silverman et al., 2013; Song, Zhang, & Manku,2009)。實驗裝置為直徑180 cm的圓形開場, 墻壁高50 cm, 底部和側(cè)壁均為黑色, 置于低照度房間中(采用40 W燈泡照明)。測試開始時將大鼠放在曠場中間, 記錄5 min中內(nèi)大鼠自發(fā)活動行為視頻。實驗結(jié)束后通過EthoVision XT動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology, Netherland)統(tǒng)計動物在曠場中的行進距離。大鼠直立行為次數(shù)人工統(tǒng)計,以大鼠兩前爪離地頭向上身體直立姿勢為判斷標準。每只大鼠測試完成后清理曠場, 以防止氣味對下一只的影響。

懸尾測試：

測試裝置為懸尾架, 高1.5 m, 正中懸掛長80 cm可360度自由轉(zhuǎn)動的掛鉤。測試時將大鼠尾部通過膠布固定在懸尾架掛鉤上, 用攝像機記錄大鼠5 min內(nèi)的活動視頻。采用EthoVision XT動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)分析大鼠懸尾5 min內(nèi)的不動時間。不動時間的延長是動物絕望情緒的表現(xiàn),也是典型的抑郁樣行為指標(Zeni, Zomkowski,Maraschin, Rodrigues, & Tasca, 2012)。

完成所有行為測試后, 通過植入導管和注射內(nèi)管向大鼠腦室注入1 μl染色劑(Chicago Sky Blue,Sigma, USA)。斷頭取腦后在插管位置做冠狀切面, 觀察染色劑是否進入側(cè)腦室以判斷插管位置是否正確,只有插管正確的大鼠的行為數(shù)據(jù)進入后續(xù)統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以“均值±標準誤” (

M

±

SEM

)表示。實驗一中兩組間對比采用獨立樣本

t

檢驗進行。實驗二中時程效應(yīng)的檢驗以藥物處理(鹽水和LPS)作為組間變量, 時間為組內(nèi)變量, 進行兩因素重復測量方差分析。事后檢驗進行各時間點上兩組均值差異的比較, 以

p

＜ 0.05為差異顯著標志。

3 結(jié)果

3.1 實驗一：腦室LPS單次和重復注射誘導的抑郁樣行為

3.1.1 單次腦室LPS注射

圖1 單次腦室LPS注射對大鼠行為的影響

結(jié)果如圖1。與對照組相比, 單次腦室LPS注射對注射后24 h時糖水偏好的影響不顯著：

t

(14) =1.45,

p

＞ 0.05。對懸尾不動時間的影響亦不顯著：

t

(12) = 0.81,

p

＞ 0.05。而對大鼠在曠場中的行為具有顯著影響, 抑制了自發(fā)活動, 降低曠場行進距離：

t

(13) = 2.42,

p

＜ 0.05; 減少曠場直立次數(shù), 抑制了探索行為：

t

(14) = 3.22,

p

＜ 0.01。由此可知單次腦室LPS只能誘發(fā)部分抑郁樣行為。

3.1.2 重復腦室LPS注射

結(jié)果如圖2。與對照組相比, 腦室LPS重復注射誘導末次注射后24 h時糖水偏好下降：

t

(14) = 3.00,

p

＜ 0.01; 懸尾不動時間增加：

t

(12) = 3.43,

p

＜ 0.01; 曠場行進距離減少：

t

(14) = 3.56,

p

＜ 0.01; 曠場直立次數(shù)減少：

t

(14) = 2.37,

p

＜ 0.05。三次隔日注射程序成功誘導了末次注射后24 h時的快感缺乏, 絕望情緒,自發(fā)活動減少, 探索行為減少等抑郁樣行為。

圖2 重復腦室LPS注射對大鼠行為的影響

3.2 實驗二：腦室LPS重復注射誘導抑郁樣行為的時程效應(yīng)

3.2.1 糖水偏好下降的時程效應(yīng)

中樞LPS處理后, 大鼠表現(xiàn)出顯著的糖水偏好下降。LPS藥物主效應(yīng)顯著：

F

(1,12) = 17.60,

p

＜0.01; 時間主效應(yīng)顯著：

F

(4,48) = 3.33,

p

＜ 0.05;藥物×時間交互效應(yīng)顯著：

F

(4,48) = 2.8,

p

＜ 0.05。事后檢驗表明末次注射后24 h兩組糖水偏好差異顯著(

p

＜ 0.001)。從末次注射后72 h至7天, LPS組糖精水消耗比例有所恢復, 逐漸接近前測基線水平, 但仍低于對照組, 見圖3B。

3.2.2 懸尾測試不動時間增加的時程效應(yīng)

懸尾不動時間的重復測量方差分析顯示, LPS藥物主效應(yīng)顯著：

F

(1,10) = 11.44,

p

＜ 0.01; 時間主效應(yīng)不顯著：

F

(4,40) = 2.06,

p

＞ 0.05; 藥物×時間交互效應(yīng)顯著：

F

(4,40) = 2.90,

p

＜ 0.05。事后檢驗表明, 重復LPS注射對不動時間的影響從末次注射后24 h持續(xù)到72 h (

p

＜ 0.001,

p

＜ 0.05), 見圖3C。

3.2.3 自發(fā)運動和探索行為減少的時程效應(yīng)

腦室LPS重復注射對大鼠在曠場中自發(fā)運動的影響見圖3D。LPS藥物主效應(yīng)顯著：

F

(1,14) =16.12,

p

＜ 0.01; 時間主效應(yīng)顯著：

F

(4,56) = 7.66,

p

＜ 0.001; 藥物×時間交互效應(yīng)顯著：

F

(4,56) = 3.28,

p

＜ 0.05。事后檢驗表明LPS組大鼠末次注射后24 h和72 h行進距離顯著低于對照組(

p

＜ 0.001,

p

＜0.01)。中樞LPS注射顯著抑制了動物的自發(fā)活動能力, 并且這種顯著差異具有一定的長時程效應(yīng)。對曠場直立行為次數(shù)的重復測量方差分析見圖3E, LPS藥物主效應(yīng)顯著：

F

(1,14) = 6.02,

p

＜0.05; 時間主效應(yīng)不顯著：

F

(4,56) = 1.72,

p

＞ 0.05;藥物×時間交互效應(yīng)顯著：

F

(4,56) = 2.88,

p

＜ 0.05。事后檢驗表明LPS組直立行為在24 h和72 h測試點上顯著低于對照組(

p

＜ 0.05), 表明中樞炎性免疫反應(yīng)抑制了動物的探索行為, 這種抑制效果具有一定的長時程效應(yīng)。

4 討論

本研究通過側(cè)腦室注射LPS, 直接激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性免疫反應(yīng), 成功誘導了大鼠的抑郁樣行為。并通過分別執(zhí)行單次和重復注射程序, 發(fā)現(xiàn)重復腦室LPS注射方法能夠建立一種穩(wěn)定的免疫激活抑郁動物模型, 誘導的抑郁樣行為具有一定的長時程效應(yīng)。中樞免疫激活大鼠在多種行為測試中表現(xiàn)出了抑郁樣行為, 糖水偏好下降表明動物出現(xiàn)快感缺乏行為, 曠場行進距離和直立次數(shù)減少表明動物的自發(fā)活動和探索活動受到抑制, 懸尾測試中LPS注射增加了動物的絕望情緒導致不動時間延長(Maes et al., 2012; Zeni et al., 2012)。不同于以往的LPS誘導的短時程行為改變, 本工作報道的抑郁樣行為持續(xù)時間超過末次注射后24 h, 大多數(shù)在72 h時仍顯著, 是具備長時程效應(yīng)的LPS誘導抑郁樣行為的新模型。

圖3 腦室LPS重復注射誘導的抑郁樣行為及其時程效應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn)單次腦室LPS注射后只有部分抑郁樣行為能夠持續(xù)至24 h, 即曠場測試中的自發(fā)活動行為有顯著差異; 而抑郁樣行為的核心指標——糖水偏好以及反映動物絕望情緒的懸尾不動時間—— 無顯著差異。這與早先 Bluthé等人(1999)報道基本一致。他們的工作表明, 單次腦室LPS注射在6 h后可表現(xiàn)出抑郁樣行為, 在24 h內(nèi)恢復。有研究認為注射LPS后24 h內(nèi)的抑郁樣行為可能受到病態(tài)行為干擾。在嚙齒類動物身上, LPS注射后2～6 h是發(fā)熱等病態(tài)行為最顯著的階段, 而注射后24 h病態(tài)行為消退到最小值(Frenois et al., 2007)。抑郁是慢性的適應(yīng)不良行為, 與病態(tài)行為產(chǎn)生機制不同, 不具有發(fā)熱的癥狀, 發(fā)病緩慢, 病程長期且反復發(fā)作, 伴有以前炎性細胞因子水平長期升高為標志的慢性炎癥反應(yīng), 以及慢性的細胞介導的免疫激活和氧化應(yīng)激反應(yīng)等(Leonard & Maes, 2012;Maes, 2009)。雖然病態(tài)行為和抑郁行為都與前炎性細胞因子在LPS注射后表達升高有關(guān), 但細胞因子引起的以c-Fos為標志的神經(jīng)元快速免疫反應(yīng)和以FosB/ΔFosB為標志的神經(jīng)元慢性免疫反應(yīng)存在時間上的分離, 即注射LPS后的6到24 h期間, c-Fos表達開始下降, 而FosB/ΔFos表達繼續(xù)升高(Frenois et al., 2007)。這說明LPS引起的抑郁行為和病態(tài)行為具有不同的神經(jīng)生理機制, LPS注射后24 h的抑郁樣行為可認為是排除了病態(tài)行為的影響。而本研究實驗一結(jié)果中, 重復腦室LPS注射所誘發(fā)的抑郁樣行為在注射后24 h仍顯著, 可知重復注射程序成功誘導了持續(xù)至24 h的抑郁樣行為, 排除了病態(tài)行為的干擾, 是一種新的更為有效的免疫激活抑郁動物模型。

一些研究者曾嘗試采用外周重復LPS注射誘發(fā)抑郁樣行為, 發(fā)現(xiàn)多次腹腔注射LPS后動物的行為表現(xiàn)與對照組不存在顯著差異(De La Garza,Pedrosa, Stearns, & Asnis, 2004; Prendergast, 2008;潘玉芹等, 2007)。這些嘗試失敗的原因可能是免疫系統(tǒng)啟動耐受機制引起多次外周LPS注射后炎癥和免疫反應(yīng)減弱(Draisma, Pickkers, Bouw, & Van der Hoeven, 2009; Lehner & Hartung, 2002)。耐受與機體受損傷后的保護機制增強有關(guān), 可以減少白細胞和內(nèi)皮細胞的激活, 降低前炎性細胞因子的分泌,增加抗炎性細胞因子IL-10等的產(chǎn)生。LPS耐受隨著注射次數(shù)增加而增強, 抑制初期注射引起的免疫激活, 使機體重新回到免疫系統(tǒng)的自我平衡狀態(tài),行為改變隨之消退。本研究中多次中樞LPS注射能夠誘發(fā)顯著抑郁樣行為, 可能與中樞對LPS的耐受低于或不同于外周有關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫細胞, 如小膠質(zhì)細胞、巨噬細胞等表面表達大量的Toll樣受體, 與LPS結(jié)合激活細胞內(nèi)部的信號轉(zhuǎn)導通路, 合成釋放前炎性細胞因子并進一步募集更多的免疫細胞, 擴大免疫激活范圍。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于血腦屏障的存在, 以及腦實質(zhì)自身的特性, 與外周免疫系統(tǒng)相比, 其免疫激活過程、細胞因子信號傳遞以及負反饋調(diào)節(jié)速度都更緩慢(Kettenmann,Hanisch, Noda, & Verkhratsky, 2011; Rivest, 2009)。中樞炎性免疫激活的這些特點可能是腦室LPS重復注射誘發(fā)長時程抑郁樣行為的原因, 但具體的神經(jīng)免疫生理機制, 以及耐受機制的啟動與效果等尚不清楚, 需要進一步研究。

臨床上抑郁癥患者常伴有長期的炎癥過程, 血液中的前炎性細胞因子IL-1、IL-6以及TNF-α等長期處于高水平(Himmerich et al., 2008; Howren et al., 2009), 長期的免疫激活可能是抑郁癥尤其是慢性抑郁的病理基礎(chǔ)(Maes, Kubera, Leunis, & Berk,2012)。因此建立能夠模擬慢性免疫激活狀態(tài)的抑郁癥動物模型一直為眾多研究者所關(guān)注, 但鮮有成功的研究見諸報道。最近Kubera等的工作顯示, 采用4個月的重復、間隔且多種劑量的LPS腹腔注射,能夠誘發(fā)雌性小鼠持續(xù)7周的快感缺乏行為(Kubera et al., 2013)。但這種方法程序復雜, 耗時很長, 建立模型比較困難; 且同樣的方法不能誘發(fā)雄性小鼠的持續(xù)抑郁樣行為, 未能充分證明外周LPS重復處理建立抑郁動物模型的可行性。相比之下,本研究所建立的腦室重復LPS注射抑郁動物模型建立途徑更為直接, 方法更為簡潔, 是具有良好可操作性的長時程免疫激活抑郁動物模型。本模型的建立提示了直接激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)可能是進一步探索穩(wěn)定有效的長期免疫激活抑郁動物模型的新途徑。

5 結(jié)論

本研究通過腦室單次和重復注射LPS, 發(fā)現(xiàn)重復注射的方法能夠建立一種新的中樞炎性免疫激活誘發(fā)的抑郁動物模型, 成功誘導了超過24 h的較長時程快感缺乏、自發(fā)活動和探索活動能力下降、懸尾不動時間增加等抑郁樣行為。這一模型彌補了以往外周單次LPS注射只能誘發(fā)數(shù)小時抑郁樣行為的不足, 為深入探索抑郁癥發(fā)病機制中免疫激活所起的作用提供了更有效的動物模型。

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