鎮(zhèn)春 王中海 鎮(zhèn)艷

缺血處理降低大鼠缺血再灌注性壓瘡細(xì)胞凋亡的實驗研究

鎮(zhèn)春 王中海 鎮(zhèn)艷

目的 研究缺血處理對大鼠缺血再灌注性壓瘡細(xì)胞凋亡的影響。方法 應(yīng)用空氣壓縮機制成缺血再灌注組(IR組)、缺血預(yù)處理組(IPC組)、缺血后處理組(I-Post C組)壓瘡模型，同時設(shè)立正常大鼠為空白組（S組），每組20只。采用Annexin V-FITC/PI（膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素/碘化丙啶）雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡百分率。結(jié)果 IPC組及I-Post C組所對應(yīng)的大鼠細(xì)胞凋亡率水平較低，IPC組細(xì)胞凋亡率為（5.80±1.03）%、I-Post C組細(xì)胞凋亡率為（5.50±1.09）%。細(xì)胞凋亡在S組內(nèi)罕見，其細(xì)胞凋亡率僅為（1.00±0.07）%。IR組所對應(yīng)大鼠細(xì)胞凋亡情況相對嚴(yán)重，其細(xì)胞凋亡率達(dá)到（9.50±5.60）%。IR組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他 3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。S組與IR組、IR組與IPC組、IR組與I-postC組、IPC組與I-postC組，在細(xì)胞凋亡率方面，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 缺血再灌注能誘發(fā)大鼠細(xì)胞凋亡的發(fā)生，缺血處理可降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，缺血預(yù)處理和后處理對降低壓瘡細(xì)胞凋亡率的療效相似。

再灌注損傷；缺血處理；壓瘡；大鼠；細(xì)胞凋亡

壓瘡是身體體表尤其是骨突部位受長時間過高壓力作用導(dǎo)致血流受阻而產(chǎn)生的皮膚和/或深層組織壞死，是臨床上一直困擾護理工作者的難題[1]。在醫(yī)療機構(gòu)中，壓瘡總的患病率為26.0%[2]，壓瘡的防治已成為社會的巨大負(fù)擔(dān)，被認(rèn)為是20世紀(jì)最昂貴和使身體衰弱的并發(fā)癥之一[3]。壓力是形成壓瘡的關(guān)鍵因素，及時減壓使組織再灌注是目前預(yù)防壓瘡的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而，進一步的研究表明，再灌注并非完全是一個良性的過程，它同時會導(dǎo)致再灌注損傷（reperfusion-injury，RI）的發(fā)生，從而加重細(xì)胞和組織的損傷[4-5]。

缺血處理（缺血預(yù)處理和后處理）不會造成損傷的疊加[6]，反而是調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制的有效措施，能夠提高組織、器官對缺血再灌注損傷的耐受能力[7]。缺血處理對機體組織，器官的保護作用可能與提高組織對缺血的耐受性、抑制中性白細(xì)胞介導(dǎo)的氧自由基的釋放、抑制細(xì)胞調(diào)亡、減輕內(nèi)皮細(xì)胞受損等因素有關(guān)[8]。而關(guān)于缺血預(yù)處理和后處理對壓瘡的保護作用機制國內(nèi)目前還不具備系統(tǒng)且規(guī)范的研究報告。

本實驗構(gòu)建大鼠缺血再灌注損傷性壓瘡動物模型，通過缺血處理干擾缺血再灌注損傷性壓瘡，旨在研究缺血處理對缺血再灌注性壓瘡損傷的保護作用及其治療機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawlye（SD）大鼠80 只，動物合格證號：SCXK（粵）2004-0011，SPF級，雄性，體重220～250g，由中山大學(xué)動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑 熒光免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（SP-9002）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒、JC-1染液、Annexin V-FITC/PI（膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素/碘化丙啶）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制作 選取成年雄性SD大鼠制作機械受壓缺血再灌注性壓瘡模型對象，由中山大學(xué)北校區(qū)動物實驗中心提供。400mg/kg劑量，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉實驗大鼠。固定大鼠于俯臥位，選取大腿股薄肌部位面積約2cm×2cm，俯臥于加壓裝置下。大鼠的四肢用膠布固定于底盤上，連接空氣壓縮機與壓力汽缸，將壓力接觸面置于大鼠大腿股薄肌處,并保持壓力頭端垂直作用于皮膚。皮膚組織在55kPa壓力下持續(xù)受壓2h。

1.2.2 動物模型分組 隨機分為4組。對照組（S組）：未施加任何壓力；缺血再灌注組(IR組)：55kPa壓力下持續(xù)缺血2h，移開壓力接觸面，血流灌注2h；缺血預(yù)處理組(IPC組)：進行3次10min間斷缺血，55kPa壓力下持續(xù)缺血2h，恢復(fù)血流灌注2h；缺血后處理組(I-PostC組)：55KPa壓力下持續(xù)缺血2h，3次10min間斷缺血，移開壓力接觸面，恢復(fù)血流灌注2h。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 制備單細(xì)胞懸液，4℃預(yù)冷 PBS 液潤洗2次，加入染料Annexin V（膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素）、PI（碘化丙啶），避光孵育15min，上機檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)計量資料采用“±s”表示，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠細(xì)胞凋亡率的比較 IPC組及I-Post C組所對應(yīng)的大鼠細(xì)胞凋亡率水平較低，IPC組細(xì)胞凋亡率為（5.80±1.03）%、I-Post C組細(xì)胞凋亡率為（5.50±1.09）%。細(xì)胞凋亡在S組內(nèi)罕見，其細(xì)胞凋亡率僅為（1.0±0.07）%。IR組所對應(yīng)大鼠細(xì)胞凋亡情況相對嚴(yán)重，其細(xì)胞凋亡率達(dá)到（9.5±5.6）%。IR組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001，見表 1）。

表1 4組骨骼肌細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

2.2 組間細(xì)胞凋亡率情況的比較 S組與IR組、IR組與IPC組、IR組與I-PostC組、IPC組與I-PostC組，細(xì)胞凋亡率組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2 四組骨骼肌細(xì)胞凋亡檢測均數(shù)的兩兩比較（α=0.05）

3 討論

近年以來的研究結(jié)果證實：骨骼肌細(xì)胞的凋亡與缺氧再灌注損傷之間存在比較密切的關(guān)系[9]?？梢哉f，骨胳肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致機體出現(xiàn)缺血再灌注損傷重要因素之一。在缺血再灌注損傷的全過程當(dāng)中，壞死反應(yīng)以及凋亡反應(yīng)均會對組織細(xì)胞的丟失情況產(chǎn)生直接影響，二者之間存在密切的相關(guān)性關(guān)系。同時，組織細(xì)胞的丟失也會對組織細(xì)胞的死亡水平產(chǎn)生影響，并會對組織功能的恢復(fù)產(chǎn)生顯著的干擾反應(yīng)。為進一步研究骨骼肌細(xì)胞的凋亡與缺氧再灌注損傷二者之間的相關(guān)性關(guān)系，本研究分別應(yīng)用缺血預(yù)處理對缺血灌注損傷進行干預(yù)、以及缺血后處理對缺血灌注損傷進行干預(yù)。實驗研究結(jié)果表明，IPC組及I-Post C組所對應(yīng)的大鼠細(xì)胞凋亡率水平較低，IPC組細(xì)胞凋亡率為（5.80±1.03）%、I-Post C組細(xì)胞凋亡率為（5.50±1.09）%。細(xì)胞凋亡在S組內(nèi)罕見，其細(xì)胞凋亡率僅為（1.00±0.07）%。IR組所對應(yīng)大鼠細(xì)胞凋亡情況相對嚴(yán)重，其細(xì)胞凋亡率達(dá)到（9.5±5.6）%。IR組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。無論是對于缺血預(yù)處理，還是對于缺陷后處理而言，其均會對大鼠骨骼肌缺血再灌注損傷情況產(chǎn)生一定的影響。

本研究S組大鼠在未對其進行缺血處理的情況下，大鼠骨骼肌細(xì)胞核凋亡率始終維持在較低水平。然而，在經(jīng)過2h缺血后、2h再灌注處理的情況，IR組當(dāng)中，大鼠骨骼肌細(xì)胞核凋亡率呈現(xiàn)出極為顯著的提升趨勢，對照預(yù)處理和后處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是可以干預(yù)的，從而提示我們可以從減輕細(xì)胞凋亡的角度預(yù)防缺氧再灌注損傷對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的破壞，即通過清除凋亡誘發(fā)因素，抑制凋亡的信息傳導(dǎo)通路，減少細(xì)胞損傷，這將會為保護缺血再灌注損傷提供新的治療途徑，具有重要的治療價值。

雖然我們對缺血處理預(yù)防壓瘡相關(guān)機制的認(rèn)識和研究還處于初始階段，而且在缺血處理如何預(yù)防正常組織發(fā)展為壓瘡的關(guān)鍵點尚未得到系統(tǒng)闡釋。需要進一步探索缺血處理防治壓瘡的最適壓力大小和模式，為缺血處理用于防治壓瘡治療模式的改進提供依據(jù)。但通過本研究可以明確，缺血預(yù)處理和缺血后處理對于壓瘡的防治具有一定的保護作用，將為壓瘡的基礎(chǔ)研究及臨床防治策略提供新的思路。

[1] Black J,Baharestani MM,Cuddigan J,et al.National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system[J].Adv Skin Wound Care 2007,10(5):269-274.

[2] Woodbury MG,Houghton PE.Prevalence of pressure ulcers in Canadian healthcare settings[J].Ostomy Wound Manage,2004,50(10):22-24.

[3] Shahin ES,Dassen T,Halfens RJ.Incidence,prevention and treatment of pressure ulcers in intensive care patients:a longitudinal study[J].Int J Nurs Stud，2009，46(4):413-421.

[4] Kloner RA.Doesre Perufsion in juryexist in humans[J].J Am Coll，1993,21(2):537-545.

[5] 高分飛，石剛.缺血-再灌注損傷研究進展[J].現(xiàn)代診斷與治療，2003，14(2):88-91.

[6] Scutz R,Cohen MV,Behrends M,et al.Signal transduction of is chemic precon-ditioning[J].Cardiovasc Res,2001,52(2):181.

[7] 王衛(wèi)國，鄧展生，龔家琳，等.缺血預(yù)處理對肢體缺血-再灌注損傷的保護作用[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2005，25(4):351-353.

[8] Kim JS,Qian T,Lemasters JJ.Mitochondrial permeability transition in the switch from necrotic to apoptotic cell death in ischemic rat hepatocytes[J].Gastroenteroloty,2003,124(2):494-503.

[9] Primeau AJ,Adhihetty PJ,Hood DA.Apoptosis in heart and skeletal muscle[J].Can J Appl Physiol，2002，27(4):349-395.

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.11.012

廣東 518000 深圳市第六人民醫(yī)院婦科 （鎮(zhèn)春 王中海） 中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔科（鎮(zhèn)艷）

鎮(zhèn)春 E-mail:zhenchun2012sz@126.com