王來亮, 羅 群

(1寧波大學醫(yī)學院， 2寧波市第二醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 寧波 315010)

腎臟纖維化是所有慢性腎臟疾病(chronickidneydisease,CKD)，包括原發(fā)性、繼發(fā)性腎小球疾病，腎小管間質(zhì)和血管疾病以及腎移植慢性排斥性病變發(fā)展至終末期腎臟病共同的最終通路。目前認為，腎臟纖維化是不可逆的進行性病變，最終需透析治療或腎移植，對患者、家庭及社會造成沉重的負擔。盡管世界各國腎臟病學者做了大量的工作，但目前對腎臟纖維化的發(fā)病機制仍缺乏全面認識，嚴重阻礙了臨床抗纖維化治療的有效進行。近年來，研究表明：在腎臟損傷過程中，多種因子可誘導上皮細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞/肌成纖維細胞，引起腎小管缺失與細胞外基質(zhì)蛋白沉積，這一過程被稱為上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)[1-2]。本文就近年來腎小管上皮細胞EMT在腎臟纖維化的作用及機制研究進展進行綜述。

1 EMT與腎臟纖維化

腎小管上皮細胞EMT是一復雜過程，主要包括4個重要特征：上皮細胞失去緊密黏附和極性；α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表達和肌動蛋白再合成；腎小管基底膜破損；細胞遷徙及浸潤性增強[2]。研究表明，腎小管上皮細胞在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β, TGF-β)誘導下發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，上皮標志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密黏連蛋白-1(zonula occludens 1, ZO-1)及細胞角蛋白(cytokeratin)表達減少，而間充質(zhì)標志蛋白波形蛋白(vimentin)、α-SMA、成纖維細胞特異蛋白-1(fibroblast-specific protein 1, FSP-1)、纖連蛋白(fibronectin, FN)及I型膠原表達增加[1-3]。轉(zhuǎn)分化的腎小管上皮細胞常伴細胞形態(tài)成纖維樣改變及遷徙能力增強，分泌大量間質(zhì)基質(zhì)蛋白，從而促進腎臟纖維化[2-3]。

腎小管上皮細胞EMT為腎間質(zhì)成纖維細胞/肌成纖維細胞的重要來源。研究表明，在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)腎病模型早期，大量腎小管上皮細胞同時表達E-鈣黏蛋白與α-SMA，提示小管上皮細胞正發(fā)生EMT；隨著病程進展，病變部位E-鈣黏蛋白消失，代之以α-SMA陽性的肌成纖維細胞[2]。與動物研究相似，在人的腎活檢組織中同樣可以觀察到腎小管上皮細胞EMT現(xiàn)象。研究報道，在不同腎臟病患者的腎活檢組織中均存在腎小管上皮細胞EMT，小管上皮可不同程度地表達肌成纖維細胞標志蛋白α-SMA及間充質(zhì)蛋白波形蛋白[4]。此外，腎小管間質(zhì)成纖維細胞/肌成纖維細胞還源于內(nèi)皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化(endothelial-mesenchymal transition, EndoMT)[5]?？梢?，腎小管間質(zhì)纖維化的成纖維細胞/肌成纖維細胞來源具有多重性。

體內(nèi)腎小管上皮細胞EMT對腎臟纖維化的作用常無法被充分評估，主要原因可能包括以下幾方面：首先，E-鈣黏蛋白、ZO-1及細胞角蛋白的丟失可能為腎小管上皮細胞損傷的普遍特征，腎小管上皮細胞EMT缺乏特異性較高的表型標志物；其次，間充質(zhì)標志物波形蛋白、α-SMA、FSP-1、FN及I型膠原等對成纖維細胞/肌成纖維細胞特異性較差，可同時存在于其它細胞如炎癥細胞和內(nèi)皮細胞等；此外，EMT為一動態(tài)過程，腎損傷后腎小管上皮細胞與內(nèi)皮細胞常發(fā)生不完全性EMT，可僅表現(xiàn)為1～2種表型蛋白的改變，且細胞可能并不離開固有的局灶微環(huán)境。因此，即使伴隨著基因標記技術的高度發(fā)展，在人體進行腎小管上皮細胞EMT的動態(tài)研究并不現(xiàn)實?？梢姡I小管上皮細胞EMT在體內(nèi)腎臟纖維化，尤其是在人慢性腎臟疾病纖維化的作用至今尚未完全闡明，仍將是未來研究腎臟纖維化的重要主題。

2 EMT調(diào)節(jié)因子

2.1正調(diào)節(jié)因子 在腎臟纖維化不同階段，腎小管及毛細血管微環(huán)境中存在多種EMT調(diào)節(jié)因子。TGF-β、血管緊張素II、醛固酮、高糖及尿白蛋白誘導EMT及腎臟纖維化，而腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)的激活可抑制此過程。在人腎近曲小管上皮細胞(HK-2)中，AMPK激活劑二甲雙胍(metformin)誘導血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1, HO-1)及內(nèi)源性抗氧化劑硫氧還蛋白(thioredoxin, TRX)的表達，調(diào)控活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的活性，從而抑制EMT。AMPK抑制劑復合維生素C及小干擾RNA抑制可阻斷此過程[6]。

除了經(jīng)典的調(diào)節(jié)因子TGF-β、血管緊張素II等外，近年研究發(fā)現(xiàn)了多種新型EMT調(diào)節(jié)因子。在腎臟纖維化早期，淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen 1, LFA-1)及細胞間黏附分子-1(intracellular adhesion molecule 1, ICAM-1)可分別作用于外周單核細胞及腎小管上皮細胞，促進小管上皮細胞EMT的發(fā)生[7]。補體系統(tǒng)與蛋白對腎小管上皮細胞EMT也有促進作用[4,8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，補體C3在小鼠UUO模型退行性腎小管中呈高表達，腎小管上皮細胞出現(xiàn)EMT[9]。此外，運用微流控與區(qū)劃芯片(microfluidic and compartmental chips)技術模擬活體近端小管微環(huán)境，也發(fā)現(xiàn)補體C3a及血清蛋白可誘導上皮細胞發(fā)生EMT，并促進細胞遷徙及形態(tài)改變[11]。有趣的是，草酸鈣可誘導巨噬細胞合成分泌促纖維化因子，促進腎小管上皮細胞EMT的發(fā)生，出現(xiàn)間充質(zhì)標志物波形蛋白表達上調(diào)，而上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白及細胞角蛋白表達下調(diào)，此過程由小G蛋白RhoA及泛素-蛋白水解酶復合體通路(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)依賴的TGF-β1信號轉(zhuǎn)號途徑介導[12]。CKD患者常伴尿酸升高，可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為E-鈣黏蛋白表達水平降低，α-SMA表達水平升高。這與尿酸促進轉(zhuǎn)錄因子Snail與Slug合成，同時增加E-鈣黏蛋白泛素化并降解相關[13]。此外，在糖尿病腎病患者中，近端小管上皮細胞神經(jīng)膠質(zhì)瘤致病相關蛋白-2(glioma pathogenesis related protein 2, GLIPR-2)水平增加[14]。研究發(fā)現(xiàn)，GLIPR-2高表達可誘導近端小管上皮細胞EMT，表現(xiàn)為間充質(zhì)標志物如波形蛋白、α-SMA合成增加，細胞遷徙能力增強，這與細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)1/2的激活密切相關[14]。

腎臟纖維化常伴組織修復與重塑，多種蛋白酶被激活并分泌進入腎小管間質(zhì)，可誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，促進腎臟纖維化[15-18]。在小鼠UUO模型中，纖維化腎臟小管上皮細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2與MMP-9表達增加，引起鄰近小管基底膜破壞，小管上皮細胞發(fā)生EMT且遷徙力增強[16-18]。其機制與MMP激活Wnt5a-Ror2信號途徑及骨橋蛋白(osteopontin, OPN)裂解有關[16-17]。需要注意的是，在腎臟纖維化的早期與晚期，MMP來源細胞可能不同，小鼠UUO模型早期，MMP-9來源主要為腎小管上皮細胞，而晚期除了腎小管上皮細胞，還包括巨噬細胞及肌成纖維細胞[17]。

2.2負調(diào)節(jié)因子 在眾多EMT調(diào)節(jié)因子中還存在多種EMT負調(diào)節(jié)因子。其中經(jīng)典負調(diào)節(jié)因子包括肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7(bonemorphogenicprotein7,BMP-7)，可直接調(diào)控TGF-β/Smad信號途徑，阻斷腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化。近年研究發(fā)現(xiàn)了多種新型腎小管上皮細胞EMT負調(diào)節(jié)因子，包括抗衰老蛋白Klotho、活性維生素D、血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、IL-7等[19-22]。在UUO動物模型中，腎臟Klotho缺乏可誘導小管上皮細胞間充質(zhì)標志物的表達增加，而外源性Klotho可抑制此過程[19-20]，提示Klotho可阻斷腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化。Klotho為Wnt內(nèi)源性拮抗劑[23-24]，其缺乏可引起Wnt/β-catenin信號通路激活，從而促進腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化，其機制可能與Wnt3a延長小管細胞在細胞周期G2/M期的停滯時間，并促進TGF-β1的釋放有關[25]?？梢?，Klotho可通過抑制Wnt/β-catenin與TGF-β1信號途徑減輕腎小管上皮EMT及腎臟纖維化。CKD患者維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)表達水平下降，出現(xiàn)腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化，活性維生素D可促進VDR的表達并抑制此過程[22]。其內(nèi)在機制尚未闡明，但研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D類似物帕立骨化醇可刺激慢性腎臟病小鼠Klotho合成分泌，升高血清和尿液Klotho水平，阻斷腎小管上皮細胞EMT[26-27]。此外，VEGF及IL-7也可阻斷腎小管上皮細胞EMT，其與腎小管上皮細胞TGF-β、TGF-βⅡ型受體、磷酸化Smad2/3、Smad3、Snai1或miR192表達受抑制[21,28]及促進Smad7合成有關[28]。

2.3microRNA 腎小管上皮細胞microRNA (miRNA)表達水平也與小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境中腎小管上皮細胞miR34a表達水平下降，Notch信號通路激活，出現(xiàn)EMT，引起上皮細胞標志物ZO-1、E-鈣黏蛋白表達減少，間充質(zhì)標志物α-SMA、波形蛋白表達增加；而miR34a類似物可抑制此過程[29]。這提示低氧環(huán)境中miR34a的低表達可能通過激活Notch信號通路調(diào)控腎小管上皮細胞EMT。此外，研究表明Notch促進EMT的機制之一與其激活誘導Snail1的表達有關[30]。甲狀腺激素T3可促進miR34a表達，阻斷TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT[31]。在腎臟纖維化早期，miRNA-200家族水平即可降低，同樣促進腎小管上皮細胞EMT[32]。研究表明，miRNA-200家族可與鋅指E-盒結合同源異形盒1(Zinc finger E-box-binding homeobox 1，ZEB1)及ZEB2靶向結合，促進腎小管上皮細胞E-鈣黏蛋白合成，抑制纖連蛋白表達，從而維持小管上皮細胞形態(tài)特征[32-33]。miRNA-200對E-鈣黏蛋白與纖連蛋白表達的調(diào)控并不依賴于磷酸化Smad2/3、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)或p42/44 MAPK信號通路的介導[33]，但也有研究得出與此不一致的結論[32]。

3 EMT信號轉(zhuǎn)導途徑

3.1TGF-β信號通路 TGF-β在纖維化腎臟中表達普遍增加，可介導腎小管上皮細胞EMT，在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中備受關注。TGF-β可通過Smad依賴性信號途徑介導EMT。TGF-β通過跨膜絲/蘇氨酸I型和II型受體促進Smad2與Smad3磷酸化，磷酸化Smad2、Smad3及Smad4形成異聚體復合物，轉(zhuǎn)移進入細胞核調(diào)控相關基因的轉(zhuǎn)錄，包括分化抑制因子2(inhibitor of differentiation 2, Id2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPAR-γ)、β-catenin、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NADPH oxidase 2, Nox2)、激活蛋白1(activator protein 1, AP-1)、Snail等[22,34-37]。需要注意的是，Smad3分子不同結構部位的磷酸化可對下游信號的表達產(chǎn)生截然相反的作用[34]。研究表明，TGF-β1通過經(jīng)典Smad 2/3信號途徑抑制Id2合成，誘導腎小管上皮細胞EMT，而BMP-7依賴Smad 1/5信號途徑可誘導Id2表達，拮抗以上過程[38]，這提示Id2可抑制上皮細胞去分化。最新研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可抑制另一EMT負調(diào)節(jié)因子癌細胞擴散抑制因子(suppressor of cancer cell invasion, SCAI)的表達，加重腎臟纖維化[39]。Gremlin為TGF-β1信號途徑下游因子，研究表明重組gremlin可誘導腎小管上皮細胞TGF-β1的表達，促進細胞外基質(zhì)沉積及小管上皮細胞EMT；利用小干擾RNA(small interfering RNA)阻斷內(nèi)源性gremlin表達可抑制此過程，提示gremlin可能成為抗腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化的新治療靶點[40]。

TGF-β還可激活腎小管上皮細胞多條非Smad依賴性EMT相關信號通路，包括p38 MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)及RhoA等。研究表明，低糖環(huán)境下TGF-β1可激活p38 MAPK，促進下游基因AP-1表達，從而引起腎小管上皮細胞EMT[37]。事實上，高糖可單獨激活p38 MAPK，促進腎小管上皮細胞下游基因AP-1的表達及EMT[37]。TGF-β激活p38 MAPK依賴于β1-整合素，而p38 MAPK激活可使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)C端磷酸化并使其失活，引起β-catenin積聚[41]。PI3K/Akt信號通路激活也與高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞EMT緊密相關，其機制可能通過促進GSK-3β磷酸化及Snail1和β-catenin的表達相關[42]。此外，腎小管上皮細胞在TGF-β誘導下發(fā)生EMT時，小G蛋白RhoA對細胞形態(tài)變化、間質(zhì)標志物如纖連蛋白、波形蛋白的表達及細胞骨架重塑也具有重要作用[12]。

3.2Wnt信號通路Wnt蛋白屬分泌型生長因子的高度保守家族成員，通過FZD受體(frizzledreceptors)共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LDL-receptor-relatedprotein,LRP)5/6調(diào)控器官發(fā)生、組織穩(wěn)態(tài)及腫瘤形成。Wnt蛋白與受體結合后，通過信號轉(zhuǎn)導促使β-catenin去磷酸化。β-catenin去磷酸化可抑制由泛素介導的降解，使其在胞漿積聚，進而與胞核T細胞因子/淋巴增強因子 1(Tcellfactor/lymphoidenhancer-bindingfactor1,TCF/LEF1)結合，促進Wnt目標基因的轉(zhuǎn)錄。

近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號途徑除了調(diào)控器官形成、腫瘤轉(zhuǎn)移等，也參與CKD尤其糖尿病腎病的腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化。Wnt信號活化主要集中在腎小管上皮細胞和腎臟間質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境中，腎小管上皮細胞Wnt、α-SMA表達增加，E-鈣黏蛋白表達降低，β-catenin在細胞漿及核內(nèi)聚積，提示糖尿病腎病腎小管間質(zhì)纖維化與Wnt/β-catenin信號通路激活密切相關[19]。Zhou等[43]研究表明高糖可以活化Aktia小鼠糖尿病模型中經(jīng)典Wnt信號通路，使用胰島素控制血糖可明顯降低該模型中Wnt信號的活化，使Wnt信號通路的組成成分表達下調(diào)；通過單克隆抗體阻斷LRP6抑制經(jīng)典Wnt信號通路能減輕腎小管上皮細胞EMT與腎臟纖維化。TGF-β與Wnt信號途徑都可激活β-catenin，β-catenin激活可能作為信號轉(zhuǎn)導的重要樞紐，促進下游基因(Snail、Twist等)的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化。

最新研究發(fā)現(xiàn)，非β-catenin依賴Wnt信號通路如Wnt5a-Ror2也可介導腎小管上皮細胞EMT及腎臟纖維化。在小鼠UUO模型中，Wnt5a與Ror2表達均上調(diào)，而Ror2在小管上皮細胞尤為明顯，同時伴間充質(zhì)標志物Snail及波形蛋白水平升高[16]。與Ror2+/-相比，Ror2+/+小鼠腎小管基底膜破壞程度明顯增加，這可能與腎小管上皮細胞Ror2的高表達常伴MMP-2合成增加，從而引起鄰近小管基底膜破壞有關[16]。

4 展望

近年，EMT在胚胎發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移及器官纖維化中的作用已成為重要的研究主題。在腎臟損傷或應激時，腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，其對腎臟纖維化的作用日益受到關注。細胞內(nèi)外存在多種調(diào)節(jié)因子，調(diào)控EMT相關信號的表達與轉(zhuǎn)導。雖然近年研究獲得一些成果，但腎小管上皮細胞EMT與腎臟纖維化還存在如下重要問題尚未解決。首先，除了上皮細胞與內(nèi)皮細胞，間質(zhì)成纖維細胞、循環(huán)纖維細胞及血管管周細胞也參與了腎臟纖維化，腎小管上皮細胞EMT在腎臟纖維化中的地位還未明確。其次，EMT涉及多種分子機制，但完整的EMT調(diào)控機制有待進一步闡明。此外，腎小管上皮細胞EMT機制的深入研究可啟動更具針對性的抗纖維化治療，但如何將已取得的研究成果轉(zhuǎn)化為具體臨床治療手段是未來工作的巨大挑戰(zhàn)。

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