鄭玉梅

（吉林省農(nóng)安縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春130200）

全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板抗體的效果觀察

鄭玉梅

（吉林省農(nóng)安縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春130200）

目的探討全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板抗體的效果，初步建立并優(yōu)化這種以全血為標(biāo)本的流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)血小板抗體的方法。方法應(yīng)用FCM，以多種參數(shù)分析全血中的CD61標(biāo)記的血小板群。結(jié)果采集檢測(cè)所需的血樣，其體積以微升為數(shù)量級(jí)單位，每次檢測(cè)需要2 h，檢測(cè)的陽性率與理論值呈明顯正相關(guān)（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗體的血小板占全部正常血小板的3%，可檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)低達(dá)10×109/L的標(biāo)本。結(jié)論采用全血法流式細(xì)胞術(shù)，所需血樣量少，較適合血小板極低或血小板抗體少的患者檢測(cè)快速，本法比傳統(tǒng)的定性檢測(cè)法與定量檢測(cè)法效果好，具有臨床推廣價(jià)值。

全血法；流式細(xì)胞術(shù)；檢測(cè)；血小板抗體；效果觀察

流式細(xì)胞儀是一種用于快速測(cè)定多量個(gè)體細(xì)胞特性的儀器，測(cè)定前對(duì)需要 析的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，壓縮氮讓樣品送入標(biāo)本室，然后射入光敏感區(qū)，射入速率高達(dá)5000～10000個(gè)細(xì)胞/秒。這時(shí)，做好的熒光標(biāo)記在一定波長的光下被激發(fā)，發(fā)射出熒光脈沖訊號(hào)，細(xì)胞的數(shù)量與信號(hào)的強(qiáng)度成正比。探測(cè)器收集儀器中的全血法流式細(xì)胞術(shù)和熒光訊號(hào)，最終傳入計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。傳統(tǒng)方法應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板膜糖蛋白的表達(dá)，常用的樣本是經(jīng)洗滌的血小板及富含血小板的血漿。血小板易于被激惹活化，在樣本離心、洗滌等過程中，極易激活體外血小板，影響臨床診斷。因此，我院引進(jìn)了全血法流式細(xì)胞術(shù)?，F(xiàn)將全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板抗體的效果觀察綜述如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取臨床ITP患者38例，其中輕度15例、中度7例、重度16例。與其年齡段一致的正常對(duì)照20例。年齡為23～45歲，平均30.2歲。單克隆抗體（mAb）CD41（GPIIb）PE（Sigma，美國）；10 g/L多聚甲醛；FITC-抗人IgM、FITC-抗人IgG、FITC-抗人IgA、HRP-人IgG（Sigm a，美國）；流式細(xì)胞儀ACScan（ Becton-Dick inso，美國）[2]。

1.2 檢查方法

①實(shí)驗(yàn)條件的確立：a.可重復(fù)性：首先考察同一實(shí)驗(yàn)操作者在相同實(shí)驗(yàn)條件下，同時(shí)對(duì)同一樣本進(jìn)行多次（=5）重復(fù)檢測(cè)時(shí)檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性；其次考察在相同實(shí)驗(yàn)條件下由不同操作人員同時(shí)對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)（次數(shù)=5）[3]。b.考察血液標(biāo)本采集后體外放置時(shí)間對(duì)FCM檢測(cè)血小板抗體的影響：分別在20 ℃下靜置0、2、3、4、6、8、16、24 h后檢測(cè)，其他操作步驟相同。c.單克隆抗體劑量的影響：在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，向同一樣本中分別加入CD61單抗5、10、 20 L，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。②FCM檢測(cè)：在管中事先涂好肝素，制備得抗凝管。用1 mL針管抽取靜脈血1 mL，注入滅菌后的抗凝管中，9∶1顛倒混勻。在顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（20～60）×109/L。操作要迅速，調(diào)整細(xì)胞數(shù)后立即向Falcon管中加入5 μL CD41PE mAb 和50 μL血標(biāo)本并混合均勻。調(diào)整恒溫箱溫度至20 ℃，遮光于暗處孵育20 min。孵育后立即加入2～8 ℃的多聚甲醛固定液，并混合均勻，保持溫度在2～8 ℃放置30 min，等待進(jìn)行FCM分析，分析要在24 h內(nèi)完成。③ELISA檢測(cè)：對(duì)分離出的血小板進(jìn)行洗滌，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，將血小板溶解，離心后棄去沉淀，取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。上清液100 μL，均勻加入96孔酶標(biāo)板，加入4 mL/LHRP- IgG（酶聯(lián)抗體），用移液槍吹打混勻，置于37 ℃下1 h。將96孔板取出，以洗滌液洗滌四遍后，向每孔加入底物100 μL，置于37 ℃下孵育10 min。取出后立即加入終止劑，在酶標(biāo)儀洗滌分離出的血小板，計(jì)數(shù)后，溶解血小板，離心沉淀，取上清100 μL 加入酶標(biāo)儀比色皿中。設(shè)置波長為492 nm，讀取比色讀數(shù)，計(jì)算含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

觀察兩組結(jié)果，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

檢測(cè)結(jié)果表明，血小板相關(guān)IgG及PAIgM的熒光強(qiáng)度隨血小板減低程度的升高發(fā)生顯著性升高（P＜0.05）。表明FCM法可用于檢測(cè)血小板相關(guān)IgG及PAIgM，進(jìn)而用于診斷ITG。用ELISA分別檢測(cè)正常人、ITP患者血小板PA IgG，檢出率分別為100%和39%，用FCM法，其檢出率則分別為24%、56.52%，EL ISA與FCM 相比，陽性檢測(cè)率明顯不足。檢測(cè)的陽性率與理論值呈明顯正相關(guān)（r＞0.9，P＜0.001），含有CD61抗體的血小板占全部正常血小板的3%，可檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)低達(dá)10×109/L的標(biāo)本。

3 討 論

經(jīng)過初步研究，我們發(fā)現(xiàn)全血法流式細(xì)胞術(shù)在樣品的處理上比傳統(tǒng)方法更為簡(jiǎn)單，ELISA法需要多種步驟，處理結(jié)果受人為因素影響較大。FCM能靈敏地從大量正常的血小板中檢出3%含有CD61抗體的血小板，與其真實(shí)含量較為接近[4]。因此應(yīng)用全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板抗體，對(duì)患者的病情診斷具有較大的幫助，且結(jié)果的重復(fù)性好，數(shù)據(jù)客觀真實(shí)。由于其樣品的前處理步驟變少，對(duì)樣品的干擾減小，樣品更接近血漿中的真實(shí)生理狀態(tài)。

[1] 鐘明華,廖軍鮮,龍紅,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞相關(guān)抗體及臨床應(yīng)用[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào),2010,15(1):3-6.

[2] 李珉珉.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板功能及其臨床應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2010,22(3):182-184.

[3] 徐成偉,盧鑫,陳穎潔,等.慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜患者PAIgG、ACA IgG 的測(cè)定及意義[J].山東醫(yī)藥,2010,42(16):12-13.

[4] 余暉,高曉陽.全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板相關(guān)抗體[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2010,26(12):1296-1298.

R446.6

B

1671-8194（2014）21-0245-01