李鐵柱，杜紅巖，王 璐

(1.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450003)

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我國特有名貴藥用樹種[1-3]，果實、葉片、樹皮、雄蕊等組織和器官中含有豐富的苯丙素類、不飽和脂肪酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素類等活性成分[4]。其中杜仲黃酮具有抗氧化、降血脂、降血脂和提高免疫力等生物活性，其含量是判斷杜仲藥材品質(zhì)的主要指標[5-9]。目前，至少有6個杜仲黃酮類化合物被分離純化，它們是斛皮素、異斛皮素、蘆丁、紫云英苷、斛皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-(1→2)-8-D-葡萄糖苷和山奈酚[10-11]。杜仲的老葉中黃酮類含量最高，其它部位的含量相差不大，并且杜仲黃酮具有良好的熱穩(wěn)定性[12]。研究表明，10～200μg/mL濃度的杜仲黃酮有促進大鼠成骨細胞表達骨鈣素(BGP)mRNA的表達水平[13]，表明杜仲黃酮在基因水平促進了BGP蛋白的合成，但對骨細胞合成Ⅰ型膠原蛋白促進作用不顯著[14]。杜仲黃酮還對動物油具有強的抗氧化能力[15]，產(chǎn)生了與氨基胍類藥物相似的抑制糖基化產(chǎn)物產(chǎn)生的功效[16]。杜仲黃酮中的斛皮素是主要的降血壓成分，它是通過促進生物體內(nèi)皮細胞釋放NO舒張血壓，還對動脈平滑肌細胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、抑制平滑肌細胞的增生及血管緊張素的生成產(chǎn)生穩(wěn)定持久的抑制作用，來舒張血管降低血壓[17-18]。

有研究證明，杜仲中的黃酮類物質(zhì)主要是槲皮素和山奈酚。槲皮素(quercetin)，別名櫟精、槲皮黃素。分子式：C15H10O7；山奈酚，別名山奈酚，又叫山奈黃酮醇、四羥基黃酮、百蕊草素，英文名：kaempferol，分子式：C15H10O6。槲皮素和山奈酚在植物體內(nèi)的合成代途徑非常相似，首先，苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(PAL)和香豆酸-CoA酶(4CL)作用下，形成對香豆酰輔酶A。1分子的對香豆酰-CoA與3分子的丙二酰-CoA在查爾酮合成酶CHS的催化下，縮合生成查爾酮，再在查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的作用下，形成柚皮素，再經(jīng)黃酮醇3-羥化酶作用形成二氫山奈酚。二氫山奈酚在類黃酮3’-羥化酶作用下，形成二氫槲皮素，最后在黃酮醇合成酶作用下，形成槲皮素[19-20]。二氫山奈酚也可直接通過黃酮醇合成酶的催化作用，形成山奈酚(見圖1)。

圖1 槲皮素和山奈酚的合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of quercetin and kaempferol

1 材料與方法

分別于2010年5月28日和10月28日，在國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心采集杜仲優(yōu)良品種“華仲6號”的葉片和果實，提取RNA，送至深圳華大基因公司進行轉(zhuǎn)錄組測序和基因功能注釋[21-22]。

轉(zhuǎn)錄組測序得到的Unigene，利用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具，和其它物種已知的黃酮合成基因的CDS序列進行在線比較，用相似性得分比較高的已知基因確定并命名杜仲轉(zhuǎn)錄組中的黃酮合成相關(guān)基因。基因確定后，分析該基因(或基因家族)在杜仲葉片和果實中的表達量，推斷該基因在杜仲黃酮生物合成中的地位和作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲轉(zhuǎn)錄組中黃酮合成途徑中被注釋的Unigene基因

杜仲葉片和果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中黃酮合成途徑共涉及5個代謝位點(見圖2)。代謝位點2.3.1.74注釋的有Unigene10852等9條Unigene，葉片和果實中差異表達基因有4條，代謝位點5.5.1.6注釋的Unigene有Unigene16591等3條，其中差異表達基因有1條；代謝位點1.14.11.9注釋的Unigene有Unigene10234等24條Unigene，其中差異表達基因有13條。代謝位點1.14.13.21注釋的Unigene有Unigene10190等42條，其中差異表達基因有20條；代謝位點1.14.11.23注釋的Unigene有10234Unigene等49條Unigene，其中差異表達基因有30條。

2.2 杜仲黃酮合成途徑相關(guān)酶基因的確定

經(jīng)過進一步BLAST分析發(fā)現(xiàn)，Unigene19573、Unigene14862 、Unigene10852 等3條Unigene與葡萄、山茶等植物的查爾酮合酶相似性達到77％～94％，其中Unigene14862為查爾酮合酶全長cDNA；Unigene21146、Unigene7680等2條Unigene與棉花等植物種的查爾酮異構(gòu)酶相似性達到73％～79％，其中Unigene21466為查爾酮異構(gòu)酶全長cDNA；Unigene13947與蛇葡萄等植物種的黃烷酮3-羥化酶相似性達到89％；Unigene14810與葡萄等植物種的類黃酮3'-羥化酶相似性達到80％，為全長cDNA；Unigene3606、Unigene40118與山茶等植物種的黃酮醇合成酶相似性分別為84％、70％(見表1)。

2.3 杜仲黃酮合成相關(guān)基因的多樣性及表達規(guī)律

2.3.1 EuCHS基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律

查爾酮合酶是黃酮合成的關(guān)鍵酶基因。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，注釋為查爾酮合酶的Unigene14862、Unigene19573、Unigene10852 等3條Unigene在葉片和果實中有表達，分別命名為EuCHS1～EuCHS3(見表2)。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫中的黃酮類物質(zhì)生物合成途徑Fig.2 The KEGG pathway of fl avonoids biosynthesis

表1 杜仲黃酮合成途徑中相關(guān)酶基因和對應Unigene相似度信息Table 1 Information of similarity between gene and Unigene in flavonoids synthesis pathway

表2 杜仲查爾酮合成酶基因信息Table 2 Information of EuCHS genes

EuCHS1(Unigene14862) 和EuCHS2(Unigene19573)在葉片和果實中的表達量存在顯著差異，EuCHS1在葉片中的表達量比果實高出7.88倍，而EuCHS2果實中的表達量比葉片高出6.56倍(見表3和圖3)。推測杜仲葉片中的查爾酮合酶以EuCHS1為主，而果實中以EuCHS2為主。葉片EuCHS基因按照表達量由大到小的順序排列依次為EuCHS1、EuCHS3、EuCHS2，果實中依次為EuCHS2、EuCHS1、EuCHS3。

表3 查爾酮合酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 3 Expression of Unigene related with EuCHS in leaf and fruit

圖3 查爾酮合酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.3 Expression difference of Unigene related with CHS in leaf and fruit

2.3.2 EuCHI基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律

在杜仲果實和葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，注釋為查爾酮異構(gòu)酶的是Unigene21146，命名為EuCHI，Unigene7680為查爾酮異構(gòu)酶依賴蛋白(見表4)。

表4 杜仲查爾酮異構(gòu)酶基因信息Table 4 Information of EuCHI genes

查爾酮異構(gòu)酶在杜仲葉片和果實中均有表達，但表達量未達到顯著水平(見表5和圖4)，查爾酮異構(gòu)酶依賴蛋白(Unigene7680)的表達量達到了顯著水平，在果實中的表達量比葉片高出2.67倍。

表5 查爾酮異構(gòu)酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 5 Expression of Unigene related with EuCHI in leaf and fruit

圖4 查爾酮異構(gòu)酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.4 Expression difference of Unigene related with CHI in leaf and fruit

2.3.3 EuF3H基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律

注釋為黃烷酮3-羥化酶(F3H)的Unigene13947在葉片和果實中有表達，且表達量存在顯著差異(見表6和圖5)，Unigene13947在果實中的表達量比葉片高出6.30倍。

表6 黃烷酮3-羥化酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 6 Expression of Unigene related with F3H in leaf and fruit

圖5 黃烷酮3-羥化酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.5 Expression difference of Unigene related with F3H in leaf and fruit

2.3.4 EuF3'H基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律

注釋為類黃酮3'-羥化酶的Unigene14810在葉片和果實中均有表達，但表達量無顯著差異(見表7和圖6)。

表7 類黃酮3'-羥化酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 7 Expression of Unigene related with F3’H in leaf and fruit

圖6 類黃酮3’-羥化酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.6 Expression difference of Unigene related with F3’H in leaf and fruit

2.3.5 EuFLS基因的多樣性和表達調(diào)控規(guī)律

黃酮醇合成酶是黃酮合成途徑的最后1個酶，也是限速酶。轉(zhuǎn)錄組分析表明，注釋為黃酮 醇 合 成 酶的 Unigene35503、Unigene3603、Unigene40118、Unigene43370等4條Unigene，分別命名為EuFLS1～EuFLS4(見表8)。

表8 黃酮醇合成酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 8 Expression of Unigene related with FLS in leaf and fruit

EuFLS1～EuFLS4在葉片和果實中均有表達，且表達量均達到顯著水平(見表9)，其中EuFLS3和EuFLS4在葉片中的表達量比果實分別高出12.98倍和44.24倍，而EuFLS1和EuFLS2在果實中的表達量比葉片分別高出15.38倍和17.65倍(見圖7)。推測杜仲葉片中的黃酮醇合成酶以EuFLS3和EuFLS4為主，而在杜仲果實中以EuFLS1和EuFLS2為主。

表9 黃酮醇合成酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達量Table 9 Expression of Unigene related with FLS in leaf and fruit

圖7 黃酮醇合成酶相關(guān)Unigene在杜仲葉片和果實中的表達差異Fig.7 Expression difference of Unigene related with FLS in leaf and young fruit

3 結(jié)論與討論

該研究揭示了杜仲黃酮(槲皮素和山奈酚)合成途徑重要基因遺傳多樣性。在幼果和成熟葉片中獲得黃酮合成相關(guān)酶11條，其中差異表達基因8條；查爾酮合酶(CHS)獲得3個家族成員(EuCHS1～EuCHS3)，EuCHS1和EuCHS2在葉片和幼果中表達量存在顯著差異，EuCHS1在葉片中的表達量比果實高7.88倍，而EuCHS2果實表達量比葉片高6.56倍，杜仲葉片以EuCHS1為主，而果實以EuCHS2為主；杜仲查爾酮異構(gòu)酶EuCHI在葉片和幼果均有表達，但表達量未達到顯著水平，獲得了查爾酮異構(gòu)酶-like protein1條，在葉片和幼果中表達量達到了顯著水平，且果實比葉片高2.67倍；杜仲黃烷酮3-羥化酶EuF3H在葉片和果實均有表達，且表達量存在顯著差異，果實比葉片高6.30倍；杜仲類黃酮3'-羥化酶EuF3′H在葉片和果實均有表達，但表達量無顯著差異，杜仲黃酮醇合成酶(FLS)基因獲得了4(EuFLS1～EuFLS4)條家族成員，EuFLS1～EuFLS4在葉片和幼果均有表達，且均達到顯著水平，其中EuFLS3和EuFLS4在葉片中的表達量比幼果分別高出12.98倍和44.24倍，而EuFLS1和EuFLS2在果實中的表達量比葉片分別高出15.38倍和17.65倍，故葉片以EuFLS3和EuFLS4為主，而果實以EuFLS1和EuFLS2為主。

槲皮素和山奈酚在植物體內(nèi)的合成代途徑非常相似，首先，苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶(PAL)和香豆酸-CoA酶(4CL)作用下，形成對香豆酰輔酶A。1分子對香豆酰-CoA的與3分子的丙二酰-CoA在查爾酮合成酶CHS的催化下，縮合生成查爾酮，再在查爾酮異構(gòu)酶(CHI)的作用下，形成柚皮素，再經(jīng)黃酮醇3-羥化酶作用形成二氫山奈酚。二氫山奈酚在類黃酮3’-羥化酶作用下，形成二氫槲皮素，最后在黃酮醇合成酶作用下，形成槲皮素。

槲皮素和山奈酚合成途徑中的基因中關(guān)鍵酶的遺傳多樣性有差異，如查爾酮合酶(CHS)和杜仲黃酮醇合成酶(FLS)的遺傳多樣性較高，在杜仲中分別獲得了3條和4條家族成員，而杜仲查爾酮異構(gòu)酶(CHI)和黃烷酮3-羥化酶F3H的基因遺傳多樣性較低，具有很高的保守性，在杜仲果實和葉片中均獲得了1條基因。在果實和葉片中查爾酮合酶(CHS)和杜仲黃酮醇合成酶(FLS)的基因表達也較復雜，杜仲葉片以EuCHS1為主，而果實以EuCHS2為主；杜仲黃酮醇合成酶(FLS)基因家族中，EuFLS3和EuFLS4在葉片中的表達量比幼果分別高出12.98倍和44.24倍，而EuFLS1和EuFLS2在果實中的表達量比葉片分別高出15.38倍和17.65倍，故葉片以EuFLS3和EuFLS4為主，而果實以EuFLS1和EuFLS2為主。故需要進一步探究杜仲查爾酮合酶和黃酮醇合成酶的遺傳多樣性與槲皮素和山奈酚以及其它活性成分的積累的相關(guān)性和控制機理。

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