仇小妹，王 英，董明盛，周劍忠,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

優(yōu)良降酸酵母菌的篩選及發(fā)酵性能

仇小妹1,2，王 英1，董明盛2，周劍忠1,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

以能夠降解L-蘋果酸的釀酒酵母FM-cs-08為出發(fā)菌株，分別進(jìn)行紫外誘變和60Co誘變，旨在誘變得到降酸能力顯著提高又具有良好發(fā)酵性能的釀酒酵母菌。最終篩選得到誘變菌株FM-cs-08-2U，降L-蘋果酸比率達(dá)到（29.48±0.21）%，比出發(fā)菌株提高了（25.44±0.89）%。對誘變菌株FM-cs-08-2U的耐受性及發(fā)酵特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明該菌株耐受最低pH值為2.5，耐受最高SO2質(zhì)量濃度為800 mg/L。用FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓果酒，得到果酒殘?zhí)橇浚?.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機(jī)酸含量（8.64±0.02）g/L，酒精度（12.00±1.00）%，結(jié)果證明菌株FM-cs-08-2U適合釀造藍(lán)莓果酒。

降酸酵母；誘變育種；發(fā)酵性能

L-蘋果酸又名L-2-羥基丁二酸，主要存在于蘋果、葡萄和不成熟的山楂等果實(shí)中[1]。蘋果酸含量高會使葡萄酒有酸澀感，酒味粗硬，如何降解果酒中的蘋果酸一直是果酒釀造中一個(gè)亟待解決的問題[2-3]。目前果酒的降酸方法主要有物理降酸法、化學(xué)降酸法和生物降酸法，但物理降酸法和化學(xué)降酸法對果酒的風(fēng)味物質(zhì)影響較大，使口感變差，降低果酒的營養(yǎng)價(jià)值，其弊端在生產(chǎn)上日益受到重視。要降低酒中蘋果酸含量，宜采用生物降酸法[4]。

果酒生物降解蘋果酸的途徑主要有兩個(gè)，其中蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）途徑主要采用乳酸菌將葡萄酒中的蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，其特點(diǎn)是降酸時(shí)有選擇性。迄今為止，國外生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒大部分采用MLF降酸。而蘋果酸-酒精發(fā)酵（malo-alcoholic fermentation，MAF）途徑是通過裂殖酵母利用糖作底物生成酒精外，還能在厭氧條件下分解蘋果酸，最終生成乙醇和CO2。裂殖酵母發(fā)酵能力較弱，且會產(chǎn)生不良?xì)馕禰4-6]。

本研究以降L-蘋果酸的釀酒酵母菌株FM-cs-08為出發(fā)菌，經(jīng)過紫外誘變和60Co誘變得到降酸效果顯著提高的誘變菌株FM-cs-08-2U，對其耐受性和發(fā)酵性能作初步探究，證明誘變菌株能降低果酒酸度的同時(shí)保持了良好的發(fā)酵能力。此研究為提高果酒品質(zhì)提供參考，并豐富釀造果酒菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降酸酵母FM-cs-08 本實(shí)驗(yàn)室保藏[7]；兔眼藍(lán)莓（含水量（89.50±0.67）%，果實(shí)直徑（1.34±0.08）cm，質(zhì)量（0.98±0.03）g/個(gè)，－20 ℃冷藏） 江蘇溧水藍(lán)莓種植基地。

葡萄糖、檸檬酸、偏重亞硫酸鈉、氯化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀（均為分析純） 廣東汕頭西隴化工股份有限公司；甲醇（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸（分析純） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；酚酞（分析純）、蒽酮（分析純） 上海浦口化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海恒科技有限公司；THZ-C-1臺式冷凍恒溫震蕩機(jī) 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SevenEasy plus pH儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16C 臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；超級水浴鍋 常州國華電器有限公司；LC2030型高效液相色譜儀 北京安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FM-cs-08生長曲線測定

以2%接種量將活化的FM-cs-08菌株接種到20 mL PDA液體培養(yǎng)基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔3 h進(jìn)行取樣，測定OD600nm。

1.3.2 降酸酵母的誘變

將甘油保藏的菌株FM-cs-08轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h。以2%接種量將菌液接種到20 mL的PDA溶液中，28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)。每隔3 h測定菌液的OD600nm，以生理鹽水做空白對照。取對數(shù)期菌液，8 000 r/min離心5～10 min獲得菌體，用生理鹽水洗滌兩次，制成菌懸液，待誘變用。

紫外誘變：分別加入5 mL菌懸液于平板上，紫外燈打開預(yù)熱30 min，然后在20 W紫外燈，距離20 cm，分別照射0、1、2、3、4、5 min；將照射后的菌液轉(zhuǎn)移到空試管中，空試管需用鉑紙裹住，0 ℃放置2 h；將照射0 min的對照菌液和經(jīng)紫外照射的菌液稀釋、涂布于固體PDA上，用黑布包起來，放置在28 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。

輻照誘變：在南京輻射中心進(jìn)行輻照誘變。取適量孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL，輻照誘變劑量為0、200、400、600 Gy。經(jīng)過60Co射線處理后的單孢子懸液稀釋、涂布于固體PDA固體培養(yǎng)基上，以未經(jīng)60Co誘變處理的菌懸液作為空白對照，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率。

1.3.3 降L-蘋果酸菌株的篩選

樣品預(yù)篩選及色譜條件選擇：根據(jù)致死率挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)24 h，按4%接種量將孢子液接種到添加了4 g/L L-蘋果酸的PDA培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min，培養(yǎng)48 h后，8 000 r/min離心10 min后取上清，經(jīng)0.22 μm膜過濾后進(jìn)行反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定。

液相色譜條件[8]：色譜柱：Agilem 20RBAX.SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：3%甲醇-97% KH2PO4緩沖溶液（0.01 mol/L）；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；檢測波長：214 nm；柱溫：常溫。

L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及L-蘋果酸定性定量測定：用純度＞99%的L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品分別配制1、2、3、4、5、6 mg/mL L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。0.22 μm膜過濾后，采用RP-HPLC分析，L-蘋果酸的吸收峰在（3.016±0.008）min出現(xiàn)，其峰面積為樣品中L-蘋果酸的含量，可以用于實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較。

1.3.4 菌株耐受性實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 耐酸能力實(shí)驗(yàn)

配制5瓶20 mL PDA液體培養(yǎng)基，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值分別為1.5、2.0、2.5、3.0，最后一瓶不做處理。將活化好的誘變菌株FM-cs-08-2U菌液，按2%的量接種于20 mL PDA液體培養(yǎng)基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔3 h取樣，以無菌生理鹽水做空白對照，測定菌液的OD600nm值。以自然pH值的PDA液體培養(yǎng)液中的菌株生長曲線為對照組，根據(jù)曲線判斷菌株耐酸能力。

1.3.4.2 耐SO2能力實(shí)驗(yàn)

配制5瓶20 mL PDA液體培養(yǎng)基，用偏重亞硫酸鈉調(diào)節(jié)SO2分別為500、600、700、800、900 mg/L。將活化好的誘變菌株FM-cs-08-2U菌液，按2%的量接種于20 mL PDA液體培養(yǎng)基中，150 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔3 h取樣，以無菌生理鹽水做空白對照，測定菌液的OD600nm值。以不添加SO2的PDA液體培養(yǎng)液中的菌株生長曲線為對照組，根據(jù)曲線判斷菌株耐SO2能力。

1.3.5 誘變菌株發(fā)酵特性研究

按照以下工藝制備4瓶200 mL發(fā)酵液置于500 mL三角瓶中：藍(lán)莓→打漿→酶解（0.3%果膠酶和0.3%復(fù)合果漿酶，40 ℃，4 h）→離心→過濾→添加16%白砂糖、0.01%偏重亞硫酸鈉→分別接種5%干酵母活化菌液及誘變菌FM-cs-08-2U菌液→20 ℃發(fā)酵至殘?zhí)橇康陀? g/L，即發(fā)酵完全。

發(fā)酵過程中取樣測定發(fā)酵液的總酸、總糖及pH值，觀察其變化?？偺呛繙y定：蒽酮-硫酸法[9]；總酸：GB/T 15038—1994《葡萄酒、果酒通用試驗(yàn)方法》中的電位滴定法，以檸檬酸計(jì)；酒精度：GB/T15038—1994中的蒸餾比重法[10]；pH值：酸度計(jì)。發(fā)酵完全后對發(fā)酵酒作感官評價(jià)。

1.3.6 致死率及降酸率的計(jì)算

1.3.6.1 致死率

式中：A1為未經(jīng)處理的菌株稀釋涂布的菌落數(shù)/（CFU/mL）；A2為誘變處理的菌株稀釋涂布的菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.6.2 降酸率

以L-蘋果酸的不同質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，外標(biāo)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到回歸方程y＝90 867x＋101 182（R2=0.999 9）。

式中：ρ0為空白對照中L-蘋果酸質(zhì)量濃度/（g/L）；ρi為不同處理樣中L-蘋果酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 FM-cs-08生長曲線及不同誘變方法對FM-cs-08致死率的影響

2.1.1 FM-cs-08生長曲線

圖1 酵母菌FM-cs-08生長曲線Fig.1 The growth cruve of the parent strain FM-cs-08

由圖1可知，3～6 h菌體處于適應(yīng)期，生長速度較慢；6～12 h，F(xiàn)M-cs-08生長迅速，此時(shí)菌株生長達(dá)到對數(shù)期對誘變比較敏感，因此一般選擇培養(yǎng)了8～9 h的菌體，進(jìn)行誘變處理。

2.1.2 紫外誘變對FM-cs-08致死率的影響

由靶子學(xué)說可知，紫外線在誘變作用之初，菌株數(shù)目很大，而此時(shí)的輻射劑量很少，輻射作用呈單擊現(xiàn)象，這時(shí)紫外光照射作用的效率很高。隨著照射時(shí)間延長，存活的菌株逐漸減少，變異菌株逐漸增加，突變率增大；一般紫外致死率在80%～90%，可保證菌體發(fā)生最大程度的突變[11-12]。由圖2可知，0～4 min菌株的致死率直線上升，在2 min時(shí)致死率達(dá)到（80.30±1.75）%，4 min時(shí)致死率達(dá)到（95.20±1.30）%，5 min之后菌株的致死率基本達(dá)到（99.86±0.23）%。所以誘變時(shí)間在2～3 min的誘變菌株突變率較高，選擇此時(shí)間段的誘變菌液進(jìn)行稀釋涂布，進(jìn)而篩選出正突變株。

圖2 紫外誘變致死率曲線Fig. 2 Fatality rate of yeast treated with UV irradiation

2.1.360Co誘變對FM-cs-08致死率的影響

圖3 36060Co誘變致死率曲線Fig.3 Fatality rate of yeast treated with60Co γ-ray irradiation

FM-cs-08對于60Co的敏感性較高，隨著誘變劑量的提高誘變菌的致死率不斷提高。如圖3所示，在誘變的3種劑量中600 Gy劑量條件下的致死率最高。在不超過90%的情況下，菌株的突變率最高，相對應(yīng)的正突變的數(shù)量也最多[13]。所以本實(shí)驗(yàn)采用600 Gy劑量條件下誘變的菌株為篩選的對象。

表1 出發(fā)菌與誘變菌降解L-蘋果酸效率Table 1 Degradation efficiencies of the parent strain and the mutant strain ffoorr L-malic aacciidd

由表1可知，空白對照中L-蘋果酸質(zhì)量濃度為（4.85±0.01）g/L，F(xiàn)M-cs-08發(fā)酵液中L-蘋果酸質(zhì)量濃度為（3.71±0.12）g/L，與空白對照相比，其L-蘋果酸含量降低了（23.50±2.47）%。

從200株經(jīng)過紫外誘變和60Co誘變的菌株中篩選出1株降酸效果最為顯著的正突變株FM-cs-08-2U，L-蘋果酸的質(zhì)量濃度為（3.42±0.01）g/L，與空白對照組比較其L-蘋果酸質(zhì)量濃度降低了（29.48±0.21）%。

2.3 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐受性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐酸度實(shí)驗(yàn)

圖4 FM-cs-08-2U在不同pH值條件下生長曲線Fig.4 Growth curves of FM-cs-08-2U at different pH values

pH值能夠改變營養(yǎng)物質(zhì)的電離程度，從而影響細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，最終影響菌體的生長[14]。 由圖4可知，與對照相比，pH 3環(huán)境中生長曲線最為接近，pH 2.5環(huán)境中生長曲線明顯出現(xiàn)滯后現(xiàn)象，生長變得緩慢，而pH 2.0與pH 1.5這兩條曲線基本維持水平，說明酵母在此pH值條件下無法正常生長。最終得出該酵母最大耐受酵母pH值為2.5。

2.3.2 誘變菌株FM-cs-08-2U的耐SO2實(shí)驗(yàn)

在果酒生產(chǎn)中SO2的作用為殺菌、澄清、抗氧化、增酸、改善口味等。適當(dāng)添加SO2有利于保持果汁的新鮮度，防止微生物的破壞和過早褐變；而添加過多，會抑制酵母活性，影響主發(fā)酵；添加過少，則達(dá)不到抑制有害微生物生長的作用，使得酒體發(fā)酸有異味[15]。

圖5 FM-cs-08-2U在不同SSOO2質(zhì)量濃度條件下生長曲線Fig.5 Growth curves of FM-cs-08-2U at different concentrations of SO2

誘變菌株FM-cs-08-2U的耐SO2質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。與對照生長曲線相比，SO2添加量為500 mg/L和600 mg/L時(shí)，菌株生長趨勢跟對照樣基本保持一致，15 h后才進(jìn)入穩(wěn)定期；SO2添加量為700 mg/L與800 mg/L時(shí)，該酵母生長雖然緩慢，但仍有生長趨勢；添加量為900 mg/L時(shí)，菌種生長受到抑制，難以生長，該菌株最大耐SO2質(zhì)量濃度為800 mg/L。

時(shí)和珅用事，世銘憂憤，與同官論前代輔臣賢否，語饑切無所避。會遷御史，則大喜，夜起彷徨，草疏將劾之，詔仍留軍機(jī)處。故事，御史留直者，儀注仍視郎官，不得專達(dá)封事。世銘自言愧負(fù)此官，阿桂慰之曰：“報(bào)稱有日，何必急以言自見。”蓋留直阿桂所請，隱全之，使有待。[9]5330

2.4 誘變菌株FM-cs-08-2U的發(fā)酵性能研究

2.4.1 誘變菌株FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓酒過程中總糖變化

圖6 FM-cs-08-2U藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中殘?zhí)橇孔兓疐ig.6 Variation in residual sugar content during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓果酒，降糖速度如圖6所示，第1周，殘?zhí)呛垦杆傧陆担粡牡?周開始降糖速度下降，趨勢較為平緩；經(jīng)過3周將殘?zhí)呛拷抵粒?.70±0.10）g/L，發(fā)酵成干酒。

2.4.2 誘變菌株FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓酒過程中總酸變化

圖7 FM-cs-08-2U藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.7 Variation in total acid content during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

藍(lán)莓汁中主要的有機(jī)酸為檸檬酸、蘋果酸，發(fā)酵過程中酵母的代謝活動改變了發(fā)酵液中有機(jī)酸組分的組成和含量[16]，總酸變化趨勢如圖7所示。發(fā)酵過程中總酸含量呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵前期，酵母代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，總酸含量增加；發(fā)酵后期，酵母菌的酒精發(fā)酵作用將有機(jī)酸降解為酒精等小分子物質(zhì)，使得總酸含量下降[17]。FM-cs-08-2U在發(fā)酵前期，代謝旺盛，總酸含量上升較快，從發(fā)酵第5天，發(fā)酵液中總酸含量開始迅速下降。降酸酵母表現(xiàn)出一定的降酸能力。

2.4.3 誘變菌株FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓酒過程中pH值變化

由于發(fā)酵液中有機(jī)酸組成發(fā)生變化，pH值也會發(fā)生一定的變化，由圖8可知，發(fā)酵過程中pH值變化不穩(wěn)定，但整體呈上升趨勢。發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母FM-cs-08-2U釀造的藍(lán)莓干酒pH值為3.18±0.01。

圖8 8FM-cs-08-2U藍(lán)莓酒發(fā)酵過程中ppHH值變化Fig.8 Variation in pH during the fermentation process of blueberry wine by FM-cs-08-2U

2.5 誘變菌株FM-cs-08-2U釀造藍(lán)莓酒的理化指標(biāo)及感官品評

用FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓果酒得到的果酒測定理化指標(biāo)，殘?zhí)橇浚ㄒ云咸烟怯?jì)）為（3.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機(jī)酸（以檸檬酸計(jì)）含量為（8.64±0.02）g/L，酒精度為（12.00±1.00）%；感官指標(biāo)：外觀深紅，澄清透亮，無懸浮物和沉淀物；具有果香、甜香及典型的酒香；口味協(xié)調(diào)，酸甜適口，后味較長。

3 結(jié) 論

與葡萄酒釀造相關(guān)的酵母菌共有18個(gè)屬，70多個(gè)種，其中部分酵母菌株具有降解蘋果酸的能力。最為典型的是，粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）通過蘋果酸-酒精發(fā)酵MLF能將蘋果酸分解為酒精和CO2，從而達(dá)到降酸的目的[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過對降酸釀酒酵母FM-cs-08進(jìn)行60Co誘變，獲得1株誘變菌株FM-cs-08-2U，降L-蘋果酸比率達(dá)到（29.48±0.21）%，比出發(fā)菌株提高了（25.44±0.89）%；耐受最低pH值為2.5，耐受最高SO2質(zhì)量濃度為800 mg/L，同時(shí)具有良好的發(fā)酵性能。用FM-cs-08-2U發(fā)酵藍(lán)莓果酒，得到的果酒殘?zhí)橇繛椋?.70±0.10）g/L，pH值為3.18±0.01，有機(jī)酸含量為（8.64±0.02）g/L，酒精度為（12.00±1.00）%，外觀深紅，澄清透明，具有典型的酒香，口味協(xié)調(diào)，酸感降低，無苦澀和異味，穩(wěn)定性好，證明FM-cs-08-2U適合釀造藍(lán)莓果酒。與Dharmadhikari等[19]用粟酒裂殖酵母中的G13-3株系發(fā)酵葡萄酒相比，F(xiàn)M-cs-08-2U降低了果酒pH值，可使含蘋果酸高的葡萄酒的酸度降低，同樣發(fā)酵的果酒沒有明顯的異味產(chǎn)生。在新西蘭，目前已廣泛采用酵母菌株Lalvin-D432和Lalvin-71B進(jìn)行葡萄酒降酸[20]。本實(shí)驗(yàn)在已有的研究基礎(chǔ)上，對降酸酵母進(jìn)行誘變育種，并對誘變菌株耐受性及發(fā)酵性能進(jìn)行了探討，豐富了釀酒酵母菌種資源。

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Strain Improvement of Saccharomyces cerevisiae for Acid Degradation and Fermentation Performance of the Screened Strain

QIU Xiao-mei1,2, WANG Ying1, DONG Ming-sheng2, ZHOU Jian-zhong1,*
(1. The Research Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Sac charomyces cerevisiae FM-cs-08, a strain with the ability to degrade L-malic acid, was treated with UV or60Co γ ray irradiation with the aim to obtain a mutant strain having improved acid-degrading ability and fermentation performance. The mutant strain was named FM-cs-08-2U, by which the degradation efficiency of L-malic acid was (29.48±0.21)%, showing a (25.44±0.89)% increase compared with the starting strain. The tolerance and fermentation performance of the mutant strain were assessed and the results showed that its lowest tolerable pH was 2.5 and its highest tolerable SO2concentration was 800 mg/L. The residual sugar content of blueberry wine fermented with FM-cs-08-2U was (3.70 ± 0.10) g/L, pH 3.18±0.01, organic acid content (8.64±0.02) g/L, and alcohol content (12.00±1.00)%. These results indicate that the selected mutant strain is suitable for brewing blueberry wine.

acid-degrading yeast; mutation breeding; fermentation performance

Q815

A

1002-6630（2014）05-0160-05

10.7506/spkx1002-6630-201405032

2013-04-02

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目（cx（11）2066）

仇小妹（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：qiuxiaomei.789@163.com

*通信作者：周劍忠（1965—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：zjzluck@yahoo.com