湯永嬌，袁宏球，朱 珠，呂岱竹,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 海口 570100）

超高效液相色譜法測定芒果中啶酰菌胺和吡唑醚菌酯

湯永嬌1,2，袁宏球2，朱 珠2，呂岱竹2,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 海口 570100）

建立芒果中殺菌劑啶酰菌胺和吡唑醚菌酯殘留檢測的超高效液相色譜方法。芒果樣品經(jīng)乙腈提取，氨基（NH2）固相萃取柱凈化，以乙腈和水為流動相梯度洗脫，采用雙波長紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：啶酰菌胺和吡唑醚菌酯含量分別在0.10～4.00 μg/mL和0.02～1.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.999，方法的檢出限均為0.002 mg/kg，分別從3 個不同添加水平檢測結(jié)果可以看出，方法的回收率在76.00%～103.00%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～13.28%。

超高效液相色譜；芒果；啶酰菌胺；吡唑醚菌酯

芒果（Mangifera indica Linn.）為漆樹科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera）熱帶常綠大喬木，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，口感細(xì)膩，素有“熱帶果王”之稱。芒果性喜濕熱，在我國廣西、廣東、海南、福建等地區(qū)種植廣泛。與此同時，熱帶地區(qū)高溫高濕的氣候特點(diǎn)使得真菌病害在農(nóng)作物上常有發(fā)生，其危害程度較溫帶地區(qū)嚴(yán)重的多。為控制病情，殺菌劑的過量使用就會造成一定的食品安全問題。芒果的炭疽病與黑斑病發(fā)病較為普遍[1-2]，且芒果尚沒有較好的抗病品種，因此，殺菌劑在芒果上的使用非常普遍。

啶酰菌胺能夠通過抑制琥珀酸基質(zhì)的氧的呼吸妨礙病原菌的能量代謝[3]，吡唑嘧菌酯能通過與線粒體復(fù)合物中細(xì)胞色素b的輔酶Q0位點(diǎn)結(jié)合而阻止線粒體中的電子傳遞從而抑制病原菌的呼吸作用[4]，二者為均為高效、廣譜、內(nèi)吸性的殺菌劑[5-6]。啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯目前正廣泛應(yīng)用于防治芒果、香蕉的炭疽病和黑斑病。隨著其大量使用必定會帶來一系列的農(nóng)藥殘留問題，所引發(fā)的食品安全問題也不容忽視。目前，國內(nèi)外檢測啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯的方法有氣相色譜法[7-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-13]、氣相色譜與離子阱-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]、液相色譜法[15-19]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-23]、酶聯(lián)免疫法[24]等。本研究利用固相萃取凈化結(jié)合超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）并采用雙波長檢測，建立了芒果中啶酰菌胺和吡唑醚菌酯快速準(zhǔn)確的分析方法，為芒果的食用安全提供了一項(xiàng)檢測技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Srata NH2柱（500 mg/3 mL，NH2柱使用前使用正己烷-丙酮（6∶4，V/V）溶液6 mL活化） 美國Phenomenex公司；乙腈、正己烷、甲醇（均為色譜純）上海Fisher Scientific公司；丙酮（色譜純） 美國Tedia公司；氯化鈉（分析純，使用前160 ℃煅燒4 h） 廣州化學(xué)試劑廠；啶酰菌胺（純度為99.5%）、吡唑醚菌酯（純度為99.6%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）美國Waters公司；IKAT25高速勻漿機(jī) 上海萬捷科技有限公司；超純水儀 成都超純科技有限公司；R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 UPLC測定條件

色譜柱：BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；梯度洗脫：流量0.25 mL/min；波長：啶酰菌胺227 nm（1.0～7.0 min）， 吡唑嘧菌酯278 nm（7.0～11.0 min）；進(jìn)樣量0.5 μL。

1.3.2 樣品前處理

提取：稱取芒果樣品20 g于高腳燒杯中，加入40 mL乙腈，高速勻質(zhì)2 min后用濾紙過濾，收集于裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，劇烈振蕩2 min后，室溫靜置20 min，待乙腈相和水相分層[25]。

凈化：移取上層乙腈相10 mL轉(zhuǎn)入50 mL圓底燒瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用6 mL 正己烷-丙酮（6∶4，V/V）溶液活化NH2柱，將待凈化的樣品用2 mL正己烷-丙酮（6∶4，V/V）溶液溶解后上樣，再分別用3 mL正己烷-丙酮（6∶4，V/V）溶液淋洗圓底燒瓶3次。收集洗脫液于圓底燒瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，甲醇定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)UPLC測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

啶酰菌胺和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：準(zhǔn)確稱取兩種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品各0.01 g，置于不同的10 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并稀釋定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的最大殘留限量分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，配制成啶酰菌胺4.00、2.00、1.00、0.50、0.10 μg/mL和吡唑醚菌酯1.00、0.50、0.10、0.05、0.02 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有樣品進(jìn)樣前均經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜過濾。在1.3.1節(jié)色譜條件下測定，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到兩種農(nóng)藥的線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍信噪比對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為方法的檢出限。

1.3.4 方法回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

采用空白芒果樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來確定方法的準(zhǔn)確度和精密度，分別添加相當(dāng)于0.50、2.00、4.00 mg/kg水平的啶酰菌胺及0.02、0.05、0.50 mg/kg水平的吡唑醚菌酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行樣品的前處理及色譜測定，計(jì)算樣品的回收率。每個添加水平連續(xù)重復(fù)6 次，測得各組的峰面積，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的選擇

要獲得較高的回收率必須選取恰當(dāng)?shù)奶崛∪軇?。本?shí)驗(yàn)根據(jù)啶酰菌胺和吡唑醚菌酯在有機(jī)溶劑中的溶解度分別選用乙腈、二氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯作為提取溶劑進(jìn)行比較。在芒果樣品中同時添加啶酰菌胺和吡唑醚菌酯后分別采用4 種溶劑進(jìn)行提取。從表1可以看出，乙酸乙酯對啶酰菌胺回收率過高，對吡唑醚菌酯回收率較低，且偏差較大。丙酮對二者的回收率都較高，但因其對各種雜質(zhì)的溶解度均較高，為避免出現(xiàn)干擾，不選擇丙酮作為提取溶劑。二氯甲烷和乙腈比較，回收率較低，但雜質(zhì)干擾很少，可以考慮不進(jìn)行凈化直接進(jìn)樣而節(jié)省操作步驟和時間。

表1 啶酰菌胺、吡唑醚菌酯在不同提取溶劑中的測定結(jié)果Table1 Effect of extraction solvents on determination of boscalid and pyraclostrobin

為進(jìn)一步驗(yàn)證，采用不同體積的二氯甲烷進(jìn)行提取。在勻漿過程中發(fā)現(xiàn)二氯甲烷易揮發(fā)，損失較多，基質(zhì)不宜分散，提取體積小不容易過濾，造成濃縮回收偏大?？紤]到樣品檢測需充分勻漿，選擇采用乙腈提取。若用二氯甲烷提取，則可以考慮使用超聲輔助提取。

2.2 凈化條件的選擇

對啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯的性質(zhì)分析后采用4 種方案進(jìn)行凈化比較，通過對比（圖 1），可以看出C18柱（甲醇-水）對吡唑醚菌酯的回收率達(dá)不到要求，C18柱（乙腈-水）、C-NH2柱（甲苯-乙腈）、NH2柱（正己烷-丙酮）回收率均在88%～106%之間。考慮到C-NH2柱（甲苯-乙腈）淋洗液中含有甲苯，毒性較大，不選擇此方案。NH2柱（正己烷-丙酮）與C18柱（乙腈-水）比較，凈化效果好，雜質(zhì)少（圖2、3）。因此采用NH2柱，正己烷-丙酮為淋洗液。經(jīng)過多次檢測，均能將大部分雜質(zhì)去掉，達(dá)到良好的凈化效果。

圖1 不同萃取柱（淋洗液）對回收率的影響（n=5）Fig.1 Effect of SPE columns (eluents) on recovery rate (n = 5)

圖2 C2C1818柱（乙腈-水）凈化效果圖Fig.2 Purification efficiency of C18SPE column (acetonitrile-water)

圖3 NH3NH2柱（正己烷-丙酮）凈化效果圖Fig.3 Purification efficiency of NH2SPE column (n-hexane-acetone)

在隨后的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著樣品中添加啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯的濃度增大，回收率有降低的趨勢。原因 可能為淋洗液中丙酮比例過小，極性太低不能將小柱上的啶酰菌胺和吡唑醚菌酯洗脫下來。在相當(dāng)于啶酰菌胺4.00 mg/kg，吡唑醚菌酯0.50 mg/kg的添加量下，對淋洗液中正己烷和丙酮的比例做了優(yōu)化，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)正己烷-丙酮（6∶4，V/V）時，效果最好，啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯的平均回收率分別為94.70%、97.07%。

圖4 淋洗液比例對回收率的影響（n=5）Fig.4 Effect of eluent composition on rec overy rate (n = 5)

2.3 色譜條件的選擇

采用等度洗脫，結(jié)果如圖5所示，啶酰菌胺和吡唑醚菌酯雖能夠完全分離，但保留時間較短，為避免之后基質(zhì)帶來干擾，遂采用梯度洗脫。

圖5 等度（A）和梯度（B）洗脫圖譜Fig.5 Isocratic (A) and gradient (B) elution spectrum

經(jīng)紫外光譜檢測，啶酰菌胺和吡唑嘧菌酯的最大吸收波長分別是227 nm和278 nm，因二者吸收波長差別較大，為保證啶酰菌胺和吡唑醚菌酯均有良好地響應(yīng)，達(dá)到最高靈敏度，采用分段波長，即1～7 min內(nèi)波長為227 nm，7～11 min內(nèi)波長為278 nm。

2.4 線性相關(guān)性

移取一定量的啶酰菌胺和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)儲備，配制成質(zhì)量濃度為0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL和0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測。以峰面積（y）對相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)樣量為1.0 μL，標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖見圖6。

外標(biāo)法定量分析結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，啶酰菌胺和吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積（y）與進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）之間呈良好的線性關(guān)系。以3 倍信噪比對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度作為方法的檢出限，結(jié)果見表2。

圖6 啶酰菌胺（4.0000 μg/mL）和吡唑醚菌酯（11..0000 μgg//mmLL）標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 Chromatogram of boscalid (4.00 μg/mL) and pyraclostrobin (1.00 μg/mL) standard

表2 啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的線性回歸方程及檢出限Table2 Calibration curves, liner ranges and detection limits for bosocalid and pyraclostrobin

2.5 方法的精密度和準(zhǔn)確度

圖7 芒果添加回收樣品（A）與空白樣品（B）色譜圖Fig.7 Chromatograms of spiked mango sample (A) and blank sample (B)

表3 啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的加標(biāo)回收率Table3 Recovery rates of bosocalid and pyraclostrobin from spiked mongo samples

在空白芒果樣品中分別按照3 個水平添加啶酰菌胺和吡唑醚菌酯（空白譜圖和添加標(biāo)準(zhǔn)品譜圖見圖7），按照1.3節(jié)中的方法進(jìn)行處理和檢測，每個質(zhì)量濃度進(jìn)行6 個平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和RSD，測得啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的回收率范圍分別在76.00%～92.00%、86.00%～103.00%之間，RSD的范圍分別在1.07%～3.08%、1.64%～13.28%之間，結(jié)果見表3。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用雙波長檢測，建立了同時測定芒果樣品中的啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的超高效液相色譜方法。通過對處理?xiàng)l件的優(yōu)化表明以正己烷-丙酮（6∶4，V/V）為洗脫液的NH2固相萃取小柱能很好的凈化芒果樣品。加標(biāo)回收驗(yàn)證方法的平均回收率在76.00%～103.00%之間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的RSD小于13.28%。該方法對啶酰菌胺和吡唑醚菌酯的檢出限均為0.002 mg/kg。本方法具有操作簡單、分析速度快、分離度好、節(jié)省溶劑用量、線性范圍寬等特點(diǎn)，適合大批量芒果樣品中啶酰菌胺和吡唑醚菌酯殘留的快速定性和定量分析。

[1] 王東方, 劉光華, 尼章光, 等. 芒果炭疽病的發(fā)病規(guī)律及防治[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(6): 67-69.

[2] 岑忠保, 潘啟城, 黃繼慶, 等. 田東縣芒果黑斑病的發(fā)病與防治[J].廣西植保, 2012, 25(1): 24-28.

[3] 顏范勇, 劉冬青, 司馬利鋒, 等. 新型煙酰胺類殺菌劑: 啶酰菌胺[J].農(nóng)藥, 2008, 47(2): 132-135.

[4] 楊麗娟, 柏亞羅. 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑: 吡唑醚菌酯[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥, 2012, 11(4): 45-50.

[5] 張亦冰. 新穎殺菌劑吡唑醚菌酯·啶酰菌胺水分散粒劑[J]. 世界農(nóng)藥, 2009(10): 52-53.

[6] Health & Consumer Protection Directorate-General. Review report for the active substance pyraclostrobin[R]. European Commission, 2004.

[7] 唐俊, 湯鋒, 操海群, 等. 啶酰菌胺在黃瓜和土壤中殘留分析方法研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 35(4): 550-554.

[8] 張玉婷, 郭永澤, 劉磊, 等. 啶酰菌胺在葡萄及土壤中的殘留動態(tài)[J].農(nóng)藥, 2011, 50(11): 50-52.

[9] 王巖, 姚威風(fēng), 梁爽, 等. 甘藍(lán)和土壤中吡唑醚菌酯·烯酰嗎啉殘留分析[J]. 農(nóng)藥, 2011, 50(1): 46-47.

[10] 張志恒, 李紅葉, 吳珉, 等. 百菌清、腈菌唑和吡唑醚菌酯在草莓中的殘留及其風(fēng)險評估[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 11(4): 449- 455.

[11] 蘇建峰, 盧聲宇, 陳晶, 等. 溶劑轉(zhuǎn)移-氣相色譜-質(zhì)譜法和選擇洗脫-氣相色譜法測定大蒜中289 種農(nóng)藥多殘留[J]. 色譜, 2011, 29(7): 643-655.

[12] REILLY T J, SMALLING K L, ORLANDO J L, et al. Occurrence of boscalid and other selected fungicides in surface water and groundwater in three targeted use areas in the United States[J]. Chemosphere, 2012, 89(3): 228-234.

[13] MUNITZ M S, RESNIK S L, MONTTI M I T. Method development and validation for boscalid in blueberries by solid-phase microextraction gas chromatography, and their degradation kinetics[J]. Food Chemistry, 2013, 136(3): 1399-1404.

[14] ALBERTO A, FABRIZIO D, VINCENZO L G, et al. Fate of iprovalicarb, indoxacarb, and boscalid residues in grapes and wine by GC-ITMS analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(12): 6806-6812.

[15] 陳莉, 賈春虹, 賀敏, 等. 草莓和土壤中啶酰菌胺殘留量的高效液相色譜分析[J]. 農(nóng)藥, 2009, 48(5): 360-364.

[16] 張志勇, 王冬蘭, 劉賢進(jìn). 西瓜與土壤中吡唑醚菌酯殘留的分析方法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(34): 19386-193878.

[17] 吳迪, 莘婧, 潘洪吉, 等. 凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜法測定花生中的吡唑醚菌酯殘留[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 14(6): 681-684.

[18] 李瑞娟, 于建壘, 宋國春. 葡萄和土壤中吡唑醚菌酯的高效液相色譜殘留分析方法[J]. 農(nóng)藥科學(xué)管理, 2010, 31(6): 33-36.

[19] 劉艷萍, 王思威, 孫海濱, 等. 吡唑醚菌酯在香蕉和土壤中的殘留消解動態(tài)[C]//中國化工學(xué)會農(nóng)藥專業(yè)委員會第十五屆年會論文集, 2012: 361-365.

[20] ZHANG Fengzu, WANG Lei, ZHOU Li, et al. Residue dynamics of pyraclostrobin in peanut and field soil by QuEChERS and LCMS/MS[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 78(1): 16-22.

[21] YOU Xiangwei, LIU Congyun, LIU Fengmao, et al. Dissipation of pyraclostrobin and its metabolite BF-500-3 in maize under field conditions[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012, 80(25): 2-7.

[22] LAURA L, MARíA-TERESA M, JESúS S, et al. Degradation intermediates and reaction pathway of pyraclostrobin with TiO2photocatalysis[J]. Applied Catalysis B: Environmental, 2012, 89(3): 285-293.

[23] 徐娟, 陳捷, 王嵐, 等. QuEChERS提取與超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測果蔬中的230 種農(nóng)藥殘留[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 2013, 23(3): 293-301.

[24] JOSEP V M, CONSUELO A, FRANCESC A E, et al. Immunoassays for pyraclostrobin analysis in processed food products using novel monoclonal antibodies and QuEChERS-based extracts[J]. Food Control, 2013, 32(1): 42-48.

[25] 農(nóng)業(yè)部. NY/T 761—2008 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測方法[S]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2008.

Determination of Boscalid and Pyraclostrobin in Mango by Ultra Performance Liquid Chromatography

TANG Yong-jiao1,2, YUAN Hong-qiu2, ZHU Zhu2, Lü Dai-zhu2,*
(1. College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. Analysis and Testing Center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 570100, China)

An ultra performance liquid chromatography (UPLC) method was established for the determination of boscalid and pyraclostrobin in mango. Samples were extracted with acetonitrile, purified on NH2column, and analyzed by gradient elution using acetonitrile-water as the mobile phase. The residues were determined by dual-wavelength ultraviolet detector, and quantified by an external standard method. An excellent linearity for boscalid and pyraclostrobin was observed in the range of 0.10-4.00 μg/mL and 0.02-1.00 μg/mL with correlation coefficients higher than 0.999, respectively. The limit of detection for both pesticides was 0.002 mg/kg. The average recovery rate for the pesticides from mongo at three spiked concentrations was in the range of 76.00%-10 3.00% with relative standard deviations of 1.07%-13.28%.

ultra performance liquid chromatography (UPLC); mango; boscalid; pyraclostrobin

O657.72

A

1002-6630（2014）20-0175-05

10.7506/spkx1002-6630-201420035

2013-11-08

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303088-13）

湯永嬌（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥殘留與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：790404271@qq.com

*通信作者：呂岱竹（1972—），女，高級工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩-mail：ldz162000@126.com