歐陽(yáng)晶，陶湘林，李梓銘，李云倩，蔣立文*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

高鹽辣椒發(fā)酵過程中主要成分及風(fēng)味的變化

歐陽(yáng)晶1,2，陶湘林1,2，李梓銘1,2，李云倩1,2，蔣立文2,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

以辣椒為原料、以高鹽辣椒發(fā)酵過程為研究對(duì)象，測(cè)定在不同發(fā)酵時(shí)段的辣椒總酸含量與亞硝酸鹽總量，利用固相微萃取技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間高鹽辣椒中的揮發(fā)性成分，并利用主成分分析法與聚類分析法對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：酸度在發(fā)酵階段變化不大，亞硝酸鹽含量在全過程中未超過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出包括烯烴類（4種）、芳香族類（9種）、醇類（13種）、醛類（7種）、酮類（3種）、酸類（2種）、酯類（18種）等7類化合物。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，初始階段辣椒中的醇類、酸類與酯類成分含量有所增加，而后醇類與酯類成分含量繼續(xù)增加，而酸類減少，最終各類成分含量更為均衡。主成分分析得出22種主要的揮發(fā)性成分。在整個(gè)發(fā)酵過程的第24天時(shí)的樣品風(fēng)味最為協(xié)調(diào)。

高鹽辣椒發(fā)酵；揮發(fā)性成分；固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；主成分分析；聚類分析

發(fā)酵辣椒又名剁辣椒，是一種香味獨(dú)特、美味可口、開胃保健的傳統(tǒng)調(diào)味品[1]，具有抗血栓[2]、消炎鎮(zhèn)痛[3]、抗氧化[4]、減肥[5]等功效。利用乳酸菌的高耐鹽性，現(xiàn)代工業(yè)制作發(fā)酵辣椒常在原料辣椒中加入大于18%的鹽進(jìn)行鹽醅發(fā)酵，然后直接包裝或脫鹽調(diào)味制成成品[6]。此法制成的辣椒不僅能保留其色澤、辣味和脆度，還能有效的抑制雜菌的繁殖、延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期，保證大批量生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。但傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵辣椒的發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、風(fēng)味形成慢、味道欠佳[7]。理化指標(biāo)與揮發(fā)性成分是剁辣椒產(chǎn)品質(zhì)量與風(fēng)味的重要指標(biāo)，探索剁辣椒高鹽發(fā)酵過程中酸度、亞硝酸鹽含量與揮發(fā)性成分旨在監(jiān)測(cè)辣椒發(fā)酵過程中主要成分與風(fēng)味物質(zhì)的變化。

本研究利用酸堿滴定法、分光光度計(jì)法與固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPMEGC-MS）對(duì)高鹽發(fā)酵過程中辣椒的酸度、亞硝酸鹽含量與揮發(fā)性成分進(jìn)行了測(cè)定，并利用SPSS軟件對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）與聚類分析（cluster analysis，CA），以期為發(fā)酵辣椒的工藝優(yōu)化、品質(zhì)保證與風(fēng)味調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇壇香4號(hào)紅線椒，產(chǎn)地湖南，購(gòu)買于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市。

亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、四硼酸鈉、4-氨基苯磺酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉（均為分析級(jí)） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃取裝置（配有手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 ?m DVB/CAR/PDMS萃取頭、20 mL頂空鉗口樣品瓶） 美國(guó)Supelco公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；GL-3250磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；7200可見分光光度計(jì)上海尤尼科儀器有限公司；SW-CJ凈化工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CP214分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高鹽辣椒的制備

挑選新鮮、成熟、無(wú)損、無(wú)蟲害的紅線椒，洗凈、去蒂并瀝干，其后用刀將辣椒切成1 cm2的小塊，加入23%（m/m）的食鹽、2%（m/m）的白酒，拌均后入壇，進(jìn)行室溫發(fā)酵，并在設(shè)定時(shí)間進(jìn)行取樣。

1.3.2 高鹽辣椒酸度、亞硝酸鹽含量以及揮發(fā)性成分的測(cè)定

測(cè)定發(fā)酵第0、6、12、18、24、30天的高鹽辣椒中酸度、亞硝酸鹽含量與發(fā)酵第0、8、16、24、32天揮發(fā)性氣味物質(zhì)。

利用GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[8]中的酸堿滴定法測(cè)定高鹽辣椒中總酸含量；利用GB/T 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽的測(cè)定》[9]中的分光光度計(jì)法測(cè)定高鹽辣椒中亞硝酸鹽含量；利用固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定高鹽辣椒中揮發(fā)性成分。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：DB-5ms毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升溫程序：初溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min，再以20 ℃/min升至270 ℃，保持1 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為He；流量1.0 mL/min。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子電離離子源；離子源溫度200 ℃；電離能量70 eV；燈絲電流150 μA；掃描質(zhì)量范圍m/z 33～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用隨機(jī)NIST 2002標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索分析，參考文獻(xiàn)[1,10-11]對(duì)機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行核對(duì)和確認(rèn)；采用峰面積歸一化法求各成分的相對(duì)含量。

得到的揮發(fā)性氣味物質(zhì)采用SPSS軟件進(jìn)行主成分與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽辣椒發(fā)酵過程中總酸與亞硝酸鹽含量的變化

發(fā)酵第0、6、12、18、24、30天的高鹽辣椒總酸與亞硝酸鹽含量見圖1。

圖1 辣椒發(fā)酵過程中總酸與亞硝酸鹽含量的變化Fig.1 Changes in total acid and nitrite contents during chili fermentation

由圖1可知，辣椒發(fā)酵前期總酸含量較為平穩(wěn)，發(fā)酵第6天達(dá)到最大，發(fā)酵第30天較前有較大的減小?？偹岷渴怯绊懤苯凤L(fēng)味的重要指標(biāo)[12]，由于發(fā)酵過程中鹽含量較高，抑制了產(chǎn)酸微生物的生長(zhǎng)，所以前期總酸主要依靠辣椒本身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解產(chǎn)生；發(fā)酵后期體系中的酵母菌、丁酸菌等微生物數(shù)量增多并分解有機(jī)酸[13]或辣椒中的各類物質(zhì)與酸發(fā)生反應(yīng)都可能是后期總酸含量下降的原因。

辣椒本身含有一定量的亞硝酸鹽，在發(fā)酵前期其亞硝酸鹽的含量接近線性增加，發(fā)酵第24天達(dá)到峰值，隨后減少。高鹽環(huán)境抑制了微生物生長(zhǎng)從而降低了亞硝酸鹽含量的增長(zhǎng)。亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物，在醬腌菜中的限量為20 mg/kg[14-15]，在發(fā)酵周期內(nèi)樣品的亞硝酸鹽含量均未超過限定值，但應(yīng)盡量避免亞硝酸鹽含量較高時(shí)期食用。

2.2 高鹽發(fā)酵辣椒過程中揮發(fā)性成分的變化

發(fā)酵第0、8、16、24、32天的高鹽辣椒的揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖見圖2。

辣椒發(fā)酵過程中共檢出56種揮發(fā)性氣味物質(zhì)，其中醇類化合物13種、醛類化合物7種、酯類化合物18種、烯烴類化合物4種、芳香族類化合物9種、酸類化合物2種、酮類化合物3種。

圖2 發(fā)酵辣椒中揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile compounds during chili fermentation

發(fā)酵第0、8、16、24、32天的高鹽辣椒揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果分析如表1。

表1 辣椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化Table 1 Changes in volatile compounds during chili fermentation

續(xù)表1

未發(fā)酵的辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以醇類與醛類為主，酯類、烯烴烷烴類、芳香族類、酮類次之，酸類最少。發(fā)酵第8天的辣椒酯類、醇類、酸類的相對(duì)含量有較大的增加，醛類、芳香族類、酮類物質(zhì)含量大幅減少。微生物分解或自然揮發(fā)可能是導(dǎo)致各大類風(fēng)味物質(zhì)均有所損失的原因；醇類物質(zhì)相對(duì)含量增加可能是發(fā)酵過程中酵母菌與乳酸菌等微生物代謝的結(jié)果；酸類物質(zhì)的增加可能還與蛋白質(zhì)分解成氨基酸有關(guān)；酸類和醇類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)隨著發(fā)酵的進(jìn)行酯類物質(zhì)逐漸增加[16]。酸類在發(fā)酵第16天后未檢出；醇類在發(fā)酵第16天達(dá)到相對(duì)含量最大，其他物質(zhì)變化不大。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酯化反應(yīng)仍在繼續(xù)。醇類、酸類物質(zhì)達(dá)到最高值后均有減少，這種現(xiàn)象可能與相關(guān)微生物代謝受到抑制有關(guān)，同時(shí)脂類、糖類、蛋白質(zhì)的自身水解的產(chǎn)物或微生物代謝產(chǎn)物之間相互作用生成各類香氣物質(zhì)使得發(fā)酵辣椒的風(fēng)味更加豐富、柔和[13]。

發(fā)酵辣椒在不同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)的揮發(fā)性成分的數(shù)據(jù)離散，單一利用種類與相對(duì)含量難以說明其對(duì)發(fā)酵辣椒風(fēng)味的貢獻(xiàn)，因此選取辣椒在不同發(fā)酵階段的揮發(fā)性氣味成分作為變量，進(jìn)行主成分分析與聚類分析[17]。

表2 主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率Table 2 Eigen values and contribution rates of principal components

累計(jì)貢獻(xiàn)率表示主成分所占全部變量信息量的比例，由表2可知，前2個(gè)主成分貢獻(xiàn)率達(dá)85.904%，說明主成分1與主成分2已能夠較為客觀的反映辣椒發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化趨勢(shì)，故選取前2個(gè)主成分進(jìn)行分析。

主成分所包含的因子的載荷系數(shù)綜合反映了辣椒中各揮發(fā)性氣味物質(zhì)對(duì)各主成分的影響，初始因子負(fù)荷矩陣負(fù)荷越大，說明主成分對(duì)該變量的代表性越強(qiáng)[18-19]。從表3可以看出，（Z）-橙花叔醇、反式-4-癸烯酸乙酯、D-檸檬烯、癸醛、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、橙花醇、水楊酸甲酯、角鯊烯、己酸己酯、正己醇、壬酸乙酯、2-己酸乙酯、己酸異丁酯與主成分1高度正相關(guān)，異戊醇、乙酸異戊酯、3-甲基-4-羰基戊酸、甲氧基-苯基-肟與主成分1呈高度負(fù)相關(guān)；苯乙醇、丁酸己酯、（S）-2-羥基-丙酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、丁子香烯、2-甲氧基-3-（2-甲基）-吡嗪、甘菊環(huán)與主成分2呈高度正相關(guān)，2-甲氧基-3-異丙基吡嗪、丁酸乙酯與主成分2呈高度負(fù)相關(guān)。而總方差85%以上的貢獻(xiàn)來自第1和第2主成分，所以可以認(rèn)為以上各物質(zhì)為辣椒發(fā)酵過程中主要的風(fēng)味物質(zhì)。

主要風(fēng)味物質(zhì)中醇類占5種，醇類常賦予產(chǎn)品新鮮的氣味，也是生成重要的風(fēng)味物質(zhì)酯類的主要來源，其中（Z）-橙花叔醇、橙花醇與苯乙醇具有令人愉悅的玫瑰香氣，正己醇具有水果芬芳香氣，異戊醇具有蘋果白蘭地香氣和辛辣味。醛類占1種，其閾值較低，賦予香氣的能力較強(qiáng)，癸醛具有甜橙和橘子香氣。酯類占17種，是辣椒發(fā)酵后期由酸和醇酯化而成的主要的呈味物質(zhì)，通常具有酒香與新鮮的水果、青草香味，但其中水楊酸甲酯具有香脂、冬青樣香氣；乙酸異成酯具有強(qiáng)烈的香蕉、生梨、蘋果的甜水果香氣，并帶有梨的甜酸味；周曉媛等[1]在自然發(fā)酵辣椒中也檢出了類似的氣味物質(zhì)。烯烴類占4種，其閾值一般較高，對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)較小，其中角鯊烯呈脂類香味，D-檸檬烯具有類似檸檬的香味[20]，丁子香烯具有溫和的丁香香氣，具有解痙作用[21]。芳香族類、酸類、酚類和酮類化合物占12種，其中甘菊環(huán)具有香樟木氣味，是番石榴的主要揮發(fā)性成分[22]。甲基庚烯酮具有新鮮的青香、柑橘樣氣息，2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮具有茶香，2-甲氧基-3-異丙基吡嗪與2-甲氧基-3-（2-甲基）-吡嗪具有堅(jiān)果香、花生香、霉味和面包香[23]，這些物質(zhì)均為發(fā)酵辣椒重要的風(fēng)味組分。

表3 主成分載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal components

表4 標(biāo)準(zhǔn)化后主成分得分Table 4 Standardized principal component scores

圖3 主成分投影圖Fig.3 Axonometric drawing of principal components

將各特征向量數(shù)據(jù)中心化和標(biāo)準(zhǔn)化后，各主成分得分如表4所示。以主成分2得分為X軸，主成分1得分為Y軸作主成分投影圖（圖3）。將發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

由圖4可知，發(fā)酵第8天與第16天的風(fēng)味物質(zhì)差別不大，發(fā)酵第24天與發(fā)酵第32天的辣椒較其他時(shí)間風(fēng)味物質(zhì)差別較大；聚類分析也說明發(fā)酵第8天與發(fā)酵第16天的辣椒可聚為一類。因此推測(cè)發(fā)酵第24天與第32天可能是風(fēng)味物質(zhì)形成的主要階段。而辣椒不同發(fā)酵時(shí)間主成分得分越高，說明此階段樣品所包含的風(fēng)味物質(zhì)越接近樣品整個(gè)發(fā)酵過程中主要的香味物質(zhì)，風(fēng)味更佳協(xié)調(diào)[24]。綜合評(píng)價(jià)可得發(fā)酵第24天的風(fēng)味協(xié)調(diào)性最佳，發(fā)酵第32天次之。

3 結(jié) 論

利用酸堿滴定法與分光光度法測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的高鹽辣椒的總酸與亞硝酸鹽含量，結(jié)果表明高鹽發(fā)酵辣椒總酸含量變化不大，發(fā)酵第6天達(dá)到最大值。亞硝酸鹽含量起初以線性增長(zhǎng)，在發(fā)酵第24天達(dá)到最大，而后減小，發(fā)酵全過程未超過國(guó)標(biāo)限量。

利用固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間的高鹽辣椒中的揮發(fā)性成分，結(jié)果表明，發(fā)酵第8天的辣椒中酯類、醇類、酸類含量有較大的增加，醛類、芳香族類、酮類物質(zhì)含量大幅減少。其后，酸類物質(zhì)在發(fā)酵第16天迅速減少。醇類含量在發(fā)酵第16天達(dá)到最大，其他物質(zhì)變化不大。但因?yàn)閾]發(fā)性成分不僅與相對(duì)含量有關(guān)，也與香氣活力值具有密切的聯(lián)系，所以判定某種成分對(duì)香氣的貢獻(xiàn)度還應(yīng)該進(jìn)行進(jìn)一步研究。

利用主成分分析法與聚類分析法分析不同發(fā)酵時(shí)間的辣椒中的揮發(fā)性成分，共分析出22種主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵第8天與第16天的風(fēng)味物質(zhì)變化不大，發(fā)酵第24天與發(fā)酵第32天的辣椒中的風(fēng)味物質(zhì)較其他階段的風(fēng)味物質(zhì)差別較大，綜合評(píng)價(jià)可得發(fā)酵第24天的風(fēng)味最為協(xié)調(diào)。

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Analysis of Changes in the Main Components and Volatile Components in Fermented Chili with High Salt Content

OUYANG Jing1,2, TAO Xiang-lin1,2, LI Zi-ming1,2, LI Yun-qian1,2, JIANG Li-wen2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China; 3. Fermented Food Engineering and Technology Research Center of Hunan Province, Changsha 410128, China)

The contents of total acids and total nitrites at different fermented stages were determined in the fermented chili with high salt content. Solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) were used to determine the volatile substances of fermented chili at different stages. The analysis of volatile substances was achieved by the principal components analysis (PCA) and cluster analysis (CA). The results indicated that there was no obvious change in acidity. The content of total nitrites did not exceed the national standard during fermentation. The compounds identified could be classified into 7 groups, including olefins (4), aromatics (9), alcohols (13), aldehydes (7), ketones (3), acids (2) and esters (18). During the initial stage of fermentation, the flavor compounds alcohols, acid and esters were increased. As the fermentation proceeded, the contents of alcohols and esters were increased while the content of acids was reduced. The contents of components from all the groups became more balanced at the end of fermentation. PCA analysis identified 22 main volatile components and the best flavor was achieved on the 24thd of fermentation.

fermented chili with high salt content; volatile components; solid phase micro-extraction-gas chromatographymass spectrometry; principal components analysis; cluster analysis

TS255.54

A

1002-6630（2014）04-0174-05

10.7506/spkx1002-6630-201404036

2013-04-15

湖南省科技廳項(xiàng)目（2012NK3092）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（SCX1220）

歐陽(yáng)晶（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。E-mail：340361409@qq.com

*通信作者：蔣立文（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食油脂與植物蛋白工程。E-mail：1024305380@qq.com