劉振春，耿存花，孫慧娟，韓 宇

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與科學(xué)工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）是世界主要的糧食作物之一，我國的高粱產(chǎn)量世界排名第二[1]。它營養(yǎng)豐富，是我國的傳統(tǒng)食物。據(jù)國外研究報(bào)道，高粱會(huì)給人們帶來新的健康理念，由于生長在干旱氣候條件下，其含有較多的二十烷醇的多酚復(fù)合物和高抗氧化水平的高粱蠟，對(duì)健康有獨(dú)特的益處，尤其對(duì)保護(hù)心血管的健康至關(guān)重要。高粱還含有較多的原花青素[2]，它是一類由黃酮類物質(zhì)衍生的多酚物質(zhì)[3]，而谷物里面的多酚物質(zhì)一直被人們認(rèn)為是營養(yǎng)的限制性因子[4]。因此高粱這種古老的作物作為21世紀(jì)的主要谷物作物引發(fā)了人們新的興趣[5]。高粱種子約含有6%～18%的蛋白質(zhì)[6]，其中醇溶蛋白是高粱蛋白的主要貯存形式[7]，約占高粱總蛋白質(zhì)的70%～90%[8]。根據(jù)分子質(zhì)量、氨基酸序列及免疫學(xué)的不同又把醇溶蛋白分為3種：α-、β-、γ-醇溶蛋白[9]。醇溶蛋白具有獨(dú)特的耐熱性、成膜性以及抗氧化性，有防潮、阻氣、保鮮、抑菌等作用[10]，是比較理想的天然保鮮劑[11-12]。迄今為止，在醇溶蛋白膜研究和開發(fā)[13-14]上已投入了大量資源。但它在食品行業(yè)中的應(yīng)用仍相當(dāng)有限，因此具有廣闊的開發(fā)前景[15]。

醇溶蛋白的提取主要用乙醇、叔丁醇、異丙醇等有機(jī)溶劑提取法[16-17]。也有研究用超臨界CO2萃取技術(shù)[18]先去除原料中的脂質(zhì)、色素等雜質(zhì)。有研究者[19]用86%的異丙醇作為溶劑提取醇溶蛋白，該方法產(chǎn)率高，但是產(chǎn)品有異味，不利于應(yīng)用于食品加工中[20]，本實(shí)驗(yàn)利用乙醇溶液作為提取劑。除此以外，使用超聲波或者微波輔助溶劑提取可有效提高醇溶蛋白的得率[21-22]。由于提取醇溶蛋白需要消耗大量的提取劑，生產(chǎn)成本較高，急需優(yōu)化高粱醇溶蛋白的提取工藝，提高其得率，降低生產(chǎn)成本。本研究采用超聲波-微波協(xié)同技術(shù)提取高粱醇溶蛋白，旨在減少溶劑用量，提高生產(chǎn)效率，為高粱的綜合利用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱 長春市售。

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、DTT（均為分析純）北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FDV超微粉粹機(jī) 日本佑崎有限公司；微型植物試樣粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；微波爐 美的公司；JY99-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；KDN-消化爐、KDN-08定氮儀 北京通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；LXJ-ⅡB離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝流程

高粱→粉碎過篩→無水乙醇脫色→離心分離→收集濾餅→75%乙醇→調(diào)pH 10.0→超聲波處理→微波處理→離心（4 000 r/min，5 min）→取上清液→冷水稀釋乙醇體積分?jǐn)?shù)至40%→調(diào)pH 6.0→靜置24 h→洗滌沉淀→熱風(fēng)干燥→粉碎→高粱醇溶蛋白

1.3.2 蛋白質(zhì)測定

采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法，蛋白質(zhì)系數(shù)為6.25。

1.3.3 高粱醇溶蛋白的鑒定和得率的計(jì)算

用紫外分光光度計(jì)測成品與高粱醇溶蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收?qǐng)D譜，最大吸收波長為278 nm，并與標(biāo)準(zhǔn)比較，判斷提取物是否為醇溶蛋白[23]。

1.3.4 單因素試 驗(yàn)

稱取5.0 g粉碎所得到的高粱粉末進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別研究不同的超聲功率、超聲處理時(shí)間、液料比、微波功率、微波處理時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響。提取的基本條件是：pH 10.0二硫蘇糖醇用量1%[24]、75%的乙醇溶液作為提取劑、液料比9∶1（mL/g）、超聲功率480 W、超聲溫度控制在50℃以內(nèi)、超聲處理時(shí)間25 min、微波功率450 W、微波處理次數(shù)5次（每次45 s，2次處理間隔時(shí)間需樣液冷卻為止）。各因素水平為：超聲功率300、360、420、480、540 W；超聲時(shí)間15、20、25、30、35 min；液料比8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1（mL/g）；微波功率270、360、450、540、630 W；微波處理時(shí)間45、135、225、315、405 s。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案

采用響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，選用Box-Behnken模型對(duì)影響超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取高粱醇溶蛋白得率的因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以高粱醇溶蛋白得率為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響

由圖1可見，超聲功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響較小，醇溶蛋白得率隨超聲功率的增加而增加，但是當(dāng)功率超過420 W后，醇溶蛋白得率略有下降，所以選擇超聲功率420 W提取高粱醇溶蛋白。根據(jù)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件處理知，P＞0.05，說明超聲功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響不顯著。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on kafirin yield

由圖2可知，超聲時(shí)間對(duì)醇溶蛋白得率產(chǎn)生了比較明顯的影響，隨著時(shí)間的延長，高粱醇溶蛋白的得率不斷增加，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，得率最高，超過25 min后，得率下降，故選用超聲時(shí)間為25 min。由SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件分析，P＜0.05，說明超聲時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響高度顯著。

2.1.3 液料比對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響

由圖3可知，在試驗(yàn)選取的液料比范圍內(nèi)，提取液用量少時(shí)得率較小，隨著提取液用量的增加，得率呈逐漸上升的趨勢(shì)，但當(dāng)液料比到10∶1（mL/g）后，得率增勢(shì)平緩，從節(jié)約成本的角度考慮，選擇液料比為10∶1（mL/g），這與Watterson等[25]結(jié)果相同。根據(jù)SAS 8.2軟件分析，P＜0.05，液料比對(duì)高粱醇溶蛋白得率有顯著性的影響。

圖3 液料比對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.3 Effect of solvent-to-material ratio on kafirin yield

2.1.4 微波功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響

圖4 微波功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on kafirin yield

由圖4可知，當(dāng)微波功率為450 W時(shí)，得率最大，超過450 W，可能由于強(qiáng)烈的熱效應(yīng)使有效成分遭到破壞，導(dǎo)致得率降低，因此，選取微波功率為450 W。根據(jù)SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件處理知，P＞0.05，說明微波功率對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響不顯著。

2.1.5 微波處理時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響

圖5 微波處理時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響Fig.5 Effect of microwave treatment time on kafirin yield

由圖5可以看出，在微波處理時(shí)間為45～225 s范圍內(nèi)時(shí)，由于細(xì)胞壁破裂程度不斷增加，225 s時(shí)，細(xì)胞破裂程度達(dá)到最大，從而使高粱醇溶蛋白得率緩慢上升，在225 s以后，高粱細(xì)胞壁基本破壁完全，同時(shí)由于持續(xù)的加熱破壞了高粱醇溶蛋白成分，而使得率下降，所以選微波時(shí)間為225 s（即微波處理5次，每次45 s）。由SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件分析，P＜0.01，說明微波時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響高度顯著。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選超聲時(shí)間、液料比、微波時(shí)間3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平利用Design-Expert 7.0軟件按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的試驗(yàn)方案對(duì)高粱醇溶蛋白提取進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

根據(jù)表1，利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此得到超聲波-微波協(xié)同輔助提取高粱醇溶蛋白得率對(duì)超聲時(shí)間、液料比、微波時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=6.72＋0.20A＋0.26B＋0.36C－0.075AB－0.088AC＋0.097BC－0.73A2－1.04B2－0.50C2。

通過方差分析從表2可以看出，該模型P＜0.001，表明回二次歸方程模型極顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，校正決定系數(shù)R2Adj=0.992 7，表明模型實(shí)際值與預(yù)測值擬合較好，失擬項(xiàng)P=0.752 6＞0.05，失擬不顯著，試驗(yàn)誤差較小，因此可用該模型對(duì)醇溶蛋白提取試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測。

表2 回歸模型各項(xiàng)方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial regression mooddeell

由表2可知，各因素對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響都極顯著，表明超聲時(shí)間、液料比和微波時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響都很大，交互項(xiàng)中除AB之間不顯著，其余均顯著，即超聲時(shí)間與微波時(shí)間，液料比與微波時(shí)間都存在交互作用，因此表明各因素對(duì)高粱醇溶蛋白得率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 雙因素交互作用分析

圖6 各兩因素交互作用對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響的響應(yīng)面分析Fig.6 Response surface plots showing the interactive effects of three extraction parameters on kafirin yield

由圖6a可以看出，當(dāng)微波時(shí)間固定在225 s時(shí)，超聲時(shí)間和液料比的交互作用不顯著，在所選范圍內(nèi)無極值；從圖6b可以看出當(dāng)液料比固定在10∶1（mL/g）時(shí)，研究超聲時(shí)間和微波時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率的交互影響，由圖6b看出，高粱醇溶蛋白得率隨著超聲時(shí)間和微波時(shí)間的延長而提高，當(dāng)超聲時(shí)間在26 min左右，微波時(shí)間在240 s左右時(shí)得率最高，超聲時(shí)間與微波時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響顯著，兩者對(duì)醇溶蛋白得率的提高起到了一定的作用。圖6c顯示，當(dāng)超聲時(shí)間為25 min時(shí)，高粱醇溶蛋白得率受液料比和微波時(shí)間交互作用影響較大，微波時(shí)間短，液料比低，高粱醇溶蛋白得率小，但微波時(shí)間過長、液料比過大則會(huì)導(dǎo)致高粱醇溶蛋白得率下降。

2.2.4 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗(yàn)證

采用Design Expert軟件，分析得到的最佳工藝條件是：超聲時(shí)間25.55 min、液料比10.14∶1（mL/g）、微波時(shí)間257.30 s，在此條件下高粱醇溶蛋白得率為6.81%?？紤]到實(shí)際操作的便利，確定提取高粱醇溶蛋白的工藝條件為超聲時(shí)間為26 min、液料比為10∶1（mL/g）、微波時(shí)間260 s，經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)，高粱醇溶蛋白的得率為6.79%，與理論值相差不大。

3 結(jié) 論

本研究運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)超聲波-微波協(xié)同輔助高粱醇溶蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果表明超聲時(shí)間、液料比、微波時(shí)間對(duì)高粱醇溶蛋白得率影響均顯著，超聲時(shí)間和微波時(shí)間、微波時(shí)間和液料比之間的交互作用顯著，但超聲時(shí)間和液料比的交互作用不顯著。超聲-微波協(xié)同輔助高粱醇溶蛋白提取工業(yè)條件為超聲時(shí)間26 min、液料比10∶1（mL/g）、微波時(shí)間260 s，在此工藝條件下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，高粱醇溶蛋白得率為6.79%。利用響應(yīng)面分析方法對(duì)超聲波-微波協(xié)同輔助提取高粱醇溶蛋白提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最佳的工藝參數(shù)，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

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