張 崇，薛飛群，張麗芳，張曉曉，王霄旸，江善祥

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，獸醫(yī)藥理與毒理實驗室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，獸藥安全評價與獸藥殘留重點開放 實驗室，上海 200241）

親水液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定羊肌肉組織中安乃近代謝物的殘留量

張 崇1,2，薛飛群2，張麗芳2，張曉曉2，王霄旸2，江善祥1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，獸醫(yī)藥理與毒理實驗室，江蘇 南京 210095；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，獸藥安全評價與獸藥殘留重點開放 實驗室，上海 200241）

建立了羊肌肉組織中安乃近4 種主要代謝物——4-甲氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林的親水液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。肌肉樣品均質(zhì)后，用體積分?jǐn)?shù)為5%的氨水乙腈提取，提取液用Cleanert PSA初步凈化，60 ℃氮氣吹干,乙腈復(fù)溶后過MAX（SPE）柱凈化，采用親水液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，4 種物質(zhì)均采用外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示：4-甲氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林在添加量為4～200 μg/kg范圍內(nèi)線性良好；4-氨基安替比林在添加量為40～2 000 μg/kg范圍內(nèi)線性良好。在5、50、100、1 000 μg/kg 4 個添加量，回收率在75.02%～116.2%范圍內(nèi)。日內(nèi)變異系數(shù)為1.63%～15.12%（n=5），日間變異系數(shù)均小于11%（n=15）。4-甲氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-乙酰氨基安替比林的檢測限均為0.5 μg/kg，4-氨基安替比林的檢測限為5 μg/kg。該方法靈敏度高、重復(fù)性好，適用于羊肌肉組織中安乃近4 種主要代謝物的大批量樣品檢測。

羊肌肉；安乃近代謝物；親水液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

安乃近（dipyrone）1922年最早在德國上市，是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥之一，屬于吡唑酮類非甾體抗炎藥[1]。安乃近被歸類為一種典型的前體藥物，經(jīng)口攝入后，被迅速水解成4-甲氨基安替比林（4-methylaminoantipyrine，MAA），經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)吸收、轉(zhuǎn)化發(fā)揮主要的藥理作用。在肝臟中MAA被進(jìn)一步氧化為4-甲酰氨基安替比林（4-formylaminoantipyrine，F(xiàn)AA），去甲基化為4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，AA）。AA又可進(jìn)一步甲?；癁镕AA或乙酰化為4-乙酰氨基安替比林（4-acetylaminoantipyrine，AAA）[2]。安乃近及其代謝物結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 安乃近及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of dipyrone and metabolites

在獸醫(yī)領(lǐng)域，安乃近主要作為一些嚴(yán)重疾病的輔助對癥藥物。由于其解熱鎮(zhèn)痛療效確切，價廉易得，經(jīng)常被長期過量使用，且由于不嚴(yán)格遵守休藥期等原因，容易在動物體內(nèi)產(chǎn)生蓄積殘留，進(jìn)而危害人類的生命健康。

安乃近不良反應(yīng)主要包括導(dǎo)致粒細(xì)胞減少、再生障礙性貧血、嚴(yán)重的過敏反應(yīng)和休克虛脫等[3-4]。鑒于其嚴(yán)重的毒性作用，美國食品藥品監(jiān)督管理局1977年取消了含安乃近的人用藥物制品的批準(zhǔn)上市，隨后包括加拿大，瑞典在內(nèi)的一些西方國家也頒布了關(guān)于禁止安乃近應(yīng)用于食源性動物的規(guī)定[5-6]。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號文件規(guī)定，安乃近在食源動物（包括牛、豬、馬）的肌肉組織中的最高殘留限量為200 μg/kg（以MAA為殘留標(biāo)示物計算）[7]，歐洲藥品管理局規(guī)定食源動物（包括牛、豬、馬）的肌肉組織中安乃近的最高殘留限量為100 μg/kg（以MAA為殘留標(biāo)示物計算）[8]。關(guān)于羊肌肉組織中最高殘留限量，中外都沒有規(guī)定。已報道的安乃近檢測方法中，國內(nèi)主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]、液相色譜法[12-14]、差示分光光度法[15]等，國外主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-17]、液相色譜二極管陣列法[5]、分光光度法[18]等，檢測對象主要是藥品制劑，城市廢水，牛、豬肌肉組織，牛奶等。對于安乃近在羊可食性組織中的殘留檢測未見有報道。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們越來越關(guān)注肉類膳食的營養(yǎng)和保健作用，國民的肉食結(jié)構(gòu)重心逐漸向味美、質(zhì)優(yōu)、滋補的羊肉轉(zhuǎn)移。為完善我國的食品安全建設(shè)，更好的保障人民的生命健康，本實驗進(jìn)行了羊肌肉組織中安乃近4 個代謝物——MAA、AA、FAA、AAA殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定方法研究。

近年來，親水液相色譜（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）技術(shù)作為反相柱的補充，被越來越多的應(yīng)用于極性和親水性化合物的分離，該類型的柱子能夠為極性化合物提供良好的保留，從而有效的提高質(zhì)譜檢測器的靈敏度[19]。因此本實驗嘗試采用Waters Atlantis HILIC色譜柱對待測物質(zhì)進(jìn)行分離，并達(dá)到了很好的定量效果。該方法快速、穩(wěn)定，靈敏度高，回收率和精密度等各項指標(biāo)均符合殘留分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉 市購；MAA、AA、FAA、AAA和4-異丙氨基安替比林標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 德國Witega公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國Thermo Fisher公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA） 北京Agela Technology公司；Waters OASISTMMAX-MCX固相萃取柱（solid phase extraction cartridge，SPE）（30 mg/cm3）美國Waters公司；其余試劑均為分析純 國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695液相色譜儀（配有Atlantis HILIC 色譜柱）美國Waters公司；Quattro Micromass MS-MS（配有電噴霧離子源） 英國Waters公司；電子天平 意大利梅特勒-托利多公司；氮吹儀 美國Organomation公司；渦旋混合器 美國Scientific Industris公司；高速勻漿機美國Waring公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5.0 mg的各種安乃近代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，避光-20 ℃保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的配制

準(zhǔn)確量取一定量的MAA、AA、FAA和AAA標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成MAA、FAA和AAA質(zhì)量濃度為0.08、0.1、0.4、1、2、4 μg/mL；AA質(zhì)量濃度為0.8、1、4、10、20、40 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.3.3 色譜條件

Atlantis HILIC Silica HPLC色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相為梯度洗脫流動相，條件如表1所示。

表1 液相分離梯度洗脫條件Table1 Mobile phase composition for gradient elution

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓3.2 kV；碰撞氣：氬氣；霧化氣：氮氣；霧化氣流速400 L/h；霧化氣溫度300 ℃；離子源溫度120 ℃。各組分的定性離子對、定量離子對、采集時間、碰撞能量和錐孔電壓見表2。

表2 安乃近殘留代謝物的保留時間和質(zhì)譜條件Table2 Retention times of dipyrone metabolites and MS-MS condition

1.3.5 樣品前處理

稱?。?.00±0.01）g肌肉組織，置于50 mL具塞玻璃離心管中，加入10 mL乙腈，500 μL氨水，1 g氯化鈉，5 g無水硫酸鈉，渦旋混合30 s，超聲提取10 min，4 000 r/min離心10 min，將上層提取液轉(zhuǎn)移至另一50 mL具塞玻璃離心管中，加入200 mg PSA，渦旋混勻10 s，4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移提取液至15 mL試管中，60 ℃恒溫水浴氮氣吹干，復(fù)溶至2 mL乙腈中。上MAX固相萃取柱（預(yù)先將MAX固相萃取柱用2 mL甲醇活化），2 mL乙腈洗滌，收集合并濾液，60 ℃恒溫水浴氮氣吹干，用1.0 mL V（0.1%甲酸＋1 g/L甲酸銨溶液）：V（乙腈）=5：95溶液定容，0.22 μm針式濾膜過濾，10 μL進(jìn)樣供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取條件的優(yōu)化

采用乙腈＋氨水、乙酸乙酯＋氨水、乙腈＋甲酸等溶液對組織中的4 種安乃近代謝物進(jìn)行提取，結(jié)果表明，采用乙腈+氨水一組提取時，效果明顯好于其他兩組。而且提取次數(shù)的增加并不會引起明顯的提取率升高，因此只用乙腈＋氨水一組提取一次，簡化前處理方法。此外，組織中的水分被無水硫酸鈉吸收，氯化鈉的加入增強了無水硫酸鈉的吸水效果，減少了氮氣吹干時間。

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

考慮到Cleanert PSA填料可以有效的去除有機酸、色素等，對提取液起到一定的凈化作用。本實驗也比較了加入200 mg Cleanert PSA與否對凈化的影響。結(jié)果表明，加入200 mg Cleanert PSA 一組4 種待測物的信號強度明顯強于未加組。

由于固相萃取小柱具有良好的凈化效果，本實驗選用固相萃取法對提取液進(jìn)行凈化。WatersOasis MCX和MAX SPE柱均屬于混合型（離子交換和反相吸附）固相萃取柱，前者采用陽離子交換反相吸附劑，對堿性化合物有高的選擇性；后者采用陰離子交換反相吸附劑，對酸性化合物有強的吸附性?？紤]到4 種待測物均屬于堿性化合物，可以通過MCX SPE柱吸附堿性藥物，再洗脫；通過MAX SPE柱吸附酸性和中性雜質(zhì)，兩種方法達(dá)到凈化目的。因此，本實驗比較了MAX、MCX固相萃取柱的富集和凈化效果。過柱的過程分別為：MAX柱一組經(jīng)甲醇活化后直接上樣穿透，并用2 mL乙腈清洗；MCX組則按照說明書操作規(guī)程進(jìn)行操作：將MCX柱用2 mL甲醇活化，2 mL體積分?jǐn)?shù)為2%甲酸水平衡后，上樣，用2 mL乙腈洗滌，最后用2 mL體積分?jǐn)?shù)為5%氨水乙腈溶液洗脫，收集最后的洗脫液。結(jié)果表明各待測物過柱后的回收率均比較理想，殘留標(biāo)示物MAA經(jīng)MAX柱凈化后信號強度稍高于MCX組?？紤]到采用MAX柱相比MCX柱可以減少平衡、清洗、洗脫等步驟，有效的節(jié)省了材料和前處理時間。故本實驗采用Waters OASIS MAX柱對樣品進(jìn)行凈化。

2.3 LC-MS-MS 條件優(yōu)化

本實驗以AA、FAA、MAA和AAA標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子掃描，確定AA、FAA、MAA和AAA的分子離子分別為：m/z 204、232、218和246，然后分別以這些離子作為母離子對其子離子進(jìn)行掃描。分別選擇各物質(zhì)豐度最強的兩個子離子作為監(jiān)測離子，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量、脫溶劑溫度和離子源溫度等質(zhì)譜條件。

本實驗比較了Waters X-terra C18色譜柱和Waters Atlantis HILIC色譜柱對待測物質(zhì)地分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HILIC柱對待測物質(zhì)有較好地分離效果，且同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)兩種色譜柱分離后，HILIC色譜柱組各待測物質(zhì)信號強度遠(yuǎn)高于C18柱組。故本實驗采用Waters Atlantis HILIC色譜柱對樣品進(jìn)行分離。

采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜監(jiān)測時，在流動相中加入一定的酸度可以使待測物容易質(zhì)子化而帶上正電荷。為了增強待測物在HILIC色譜柱上的保留，改善峰形，通常在流動相中加入緩沖鹽（如甲酸銨、乙酸銨等）。本實驗通過優(yōu)化液相分離條件，發(fā)現(xiàn)流動相選擇（1 g/L甲酸銨＋0.1%甲酸）溶液-乙腈，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，各待測物質(zhì)得到了較好地分離，且在質(zhì)譜上有較強的響應(yīng)。

2.4 定量方法的選擇

實驗發(fā)現(xiàn)參考沈金燦等[12]的定量方法，采用MAA的結(jié)構(gòu)類似物4-異丙氨基安替比林作為內(nèi)標(biāo)對待測物進(jìn)行定量時，在本實驗的條件下，4-異丙氨基安替比林始終對AA的出峰有干擾，并影響AA的定量。因此，本實驗嘗試外標(biāo)法作為定量方法，結(jié)果如表3所示，4 種待測物均得到較好的定量效果。

2.5 專屬性

分別按照1.3.5節(jié)前處理方法對空白羊肌肉組織和空白添加標(biāo)樣的樣品提取制備后進(jìn)行測定，由圖2可知，在4 種待測物質(zhì)的保留時間區(qū)域內(nèi)均沒有明顯的干擾物質(zhì)出現(xiàn)，該結(jié)果表明本方法的專屬性良好。

圖2 空白樣品和加標(biāo)樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of blank goat muscle and spiked blank goat muscle

2.6 線性關(guān)系和定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，本實驗選擇了空白添加標(biāo)準(zhǔn)曲線作為線性校正曲線。將各濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液100 μL分別加入2 g空白勻漿羊肌肉組織中，配制成含量為AA：40、50、200、500、1 000、2 000 μg/kg；FAA、MAA、FAA：4、5、20、50、100、200 μg/kg的羊組織樣品，按1.3.5節(jié)提取測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)肌肉組織中各物質(zhì)的添加量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示4 種待測物質(zhì)濃度與其對應(yīng)的峰面積值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（表3）。以3倍信噪比條件下確定檢測限，10倍信噪比條件下確定定量限。得出MAA、FAA和AAA在肌肉組織中的檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1 μg/kg；AA在肌肉組織中的檢測限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg。圖2為空白羊肌肉組織和添加1 μg/kg的MAA、FAA和AAA，10 μg/kg的AA時得到的各待測物定量離子對的色譜圖。

表3 4 種待測物的線性關(guān)系Table3 Calibration curve or four analytes

2.7 準(zhǔn)確度和精密度

表4 羊肌肉組織中安乃近4 種代謝物的回收率和批內(nèi)批間精密度Table4 Recoveries and precision (RSD) of dipyrone metabolites in goat muscle

本檢測方法的準(zhǔn)確度采用相對回收率來評價。取空白羊肌肉組織2.00 g，選擇4 種代謝物3 個不同的添加量（AA為50、500、1 000 μg/kg，MAA、FAA、AAA為5、50、100 μg/kg），每個添加量5個重復(fù)，添加到空白組織中按照1.3.5節(jié)樣品前處理方法處理后進(jìn)行檢測。樣品的相對回收率按2.6節(jié)方法制備的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

本方法的精密度包括日內(nèi)精密度和日間精密度，都采用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來評價。選擇4 種代謝物3 個不同的添加量（AA為50、500、1 000 μg/kg，MAA、FAA、AAA為5、50、100 μg/kg），每個添加量5 個重復(fù)，連續(xù)測定3 d，并用當(dāng)天的空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算得到實測值，再分別計算日內(nèi)精密度和日間精密度。

準(zhǔn)確度和精密度的結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，添加5 μg/kg實驗，待測物的回收率在75.44%～116.16%之間；添加50 μg/kg實驗，回收率在75.02%～107.35%之間，添加500、1 000 μg/kg實驗，回收率在95.38%～110.04%之間。4 種待測物在5、50、100 μg/kg添加實驗，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤16%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤16%；添加500、1 000 μg/kg實驗，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤11%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%。本方法的準(zhǔn)確度和精密度完全符合國內(nèi)外相關(guān)法律法規(guī)的要求。

3 3 結(jié) 論

該實驗成功建立了羊肌肉組織中安乃近的4 種主要代謝物的HPLC-MS-MS檢測方法。用HILIC色譜柱分離，有效的提高了質(zhì)譜的靈敏度。對比Piotr[16]和Lisa[17]等報道的方法，本研究具有較低的檢測限，與沈金燦等[11]報道的研究相比，本方法在具有相近靈敏度的前提下，極大的簡化了前處理過程，實現(xiàn)了一個工作日內(nèi)對大批量樣品的檢測。方法的回收率和精密度均符合SN/T 0005—1996《出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留量及生物毒素檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)編寫的基本規(guī)定》[20]。方法的定量限低，重復(fù)性好，前處理方法經(jīng)濟、高效，可用于大批量實際樣品的殘留檢測。

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Simultaneous Determination of Residues of Four Dipyrone Metabolites in Go at Muscle by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

ZHANG Chong1,2, XUE Fei-qun2, ZHANG Li-fang2, ZHANG Xiao-xiao2, WANG Xiao-yang2, JIANG Shan-xiang1,*
(1. Laboratory of Veterinary Pharmacology and Toxicology, College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Veterinary Drug Safety Evaluation and Residue Research, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China)

A hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry (HILIC-MS) method was developed for the determination of four dipyrone metabolites, namely 4-methylaminoantipyrine (MAA), 4-aminoantipyrine (AA), 4-formylaminoantipyrine (FAA), and 4-acetylaminoantipyrine (AAA) in goat muscle. These metabolites were extracted with acetonitrile mixed with 5% ammonia. The extracts were cleaned up with Cleaner PSA, and then blow-dried by nitrogen gas, re-dissolved in acetonitrile and re-cleaned up using MAX (SPE) cartridge. After chromatographic separation, the analytes were quantifi ed by the external standard method. The calibration curves were linear between 4 and 200 μg/kg matrix equivalent concentrations for MAA, FAA, and AAA, and between 40 and 2 000 μg/kg for AA. The mean recoveries in blank samples at four spike levels (5, 50, 100, and 1 000 μg/kg) ranged between 75.02% and 116.2%. The intra-day coeffi cient of variation (CV) was 1.63% to 15.12% (n = 5), and the inter-day CV was less than 11% (n = 15). The detection limits were 0.5 μg/kg for MAA, FAA and AAA and 5 μg/kg for AA. The proposed method is sensitiv e and repeatable, allowing analysis of a large number of samples in a working day.

goat muscle; dipyrone metabolites; hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

S859.84

A

1002-6630（2014）10-0158-05

10.7506/spkx1002-6630-201410029

2013-09-16

2013年農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè) 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目（2013-550）

張崇（1987—），男，碩士，研究方向為基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)。E-mail：CQ1301@126.com

*通信作者：江善祥（1966—），男，教授，博士，研究方向為新獸藥及制劑。E-mail：nauvy@sina.com