卞夢(mèng)瑤，方 勇，裴 斐，趙立艷，辛志宏，安辛欣，楊方美，胡秋輝,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

卞夢(mèng)瑤1，方 勇2，裴 斐1，趙立艷1，辛志宏1，安辛欣1，楊方美1，胡秋輝1,*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

目的：研究生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起的RAW264.7巨噬細(xì)胞損傷的影響。方法：以生姜油樹(shù)脂為研究對(duì)象，建立RAW264.7細(xì)胞的過(guò)氧化氫損傷模型，測(cè)定質(zhì)量濃度分別為1、3、5 μg/mL的生姜油樹(shù)脂聯(lián)合過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果：生姜油樹(shù)脂各劑量組均能顯著緩解過(guò)氧化氫引起的RAW264.7細(xì)胞的損傷，降低細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的丙二醛含量，提高谷胱甘肽含量以及超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，其中5 μg/mL生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用效果最好。結(jié)論：生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起的RAW264.7細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是生姜油樹(shù)脂通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)，提高抗氧化能力，有效清除自由基的產(chǎn)生，從而對(duì)細(xì)胞的氧化性損傷起保護(hù)作用。

生姜油樹(shù)脂；RAW264.7；過(guò)氧化氫；抗氧化

研究表明，當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時(shí)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧并導(dǎo)致機(jī)體自身抗氧化能力的下降?；钚匝醯那宄蛔銜?huì)產(chǎn)生大量的自由基導(dǎo)致細(xì)胞的氧化性損傷。自由基通過(guò)線(xiàn)粒體膜、呼吸鏈等造成線(xiàn)粒體損傷，主要表現(xiàn)在線(xiàn)粒體腫大，內(nèi)外膜通透性增大，引起氧化磷酸化及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成障礙，影響到細(xì)胞的正常生理功能[1]。通常生物體會(huì)利用抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)活性氧進(jìn)行清除，抗氧化體系包括抗氧化物酶和非酶促系統(tǒng)，其中酶促系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismu tase，SOD）、過(guò)氧化氫酶等，是細(xì)胞內(nèi)清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要保護(hù)酶；非酶促系統(tǒng)主要包括一些小分子抗氧化物，如還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[2-3]。SOD、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、GSH以及脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）是機(jī)體的主要抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)[4-5]。張健等[6]建立ECV-304細(xì)胞過(guò)氧化氫氧化損傷模型，以MDA和抗氧化酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究卡維地洛對(duì)過(guò)氧化氫致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。Ju Hengyin等[7]以MDA和抗氧化酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，說(shuō)明女貞子中的抗氧化酚類(lèi)物質(zhì)通過(guò)清除自由基活性以及提高抗氧化酶活性從而發(fā)揮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的中藥被認(rèn)為是外源性的“天然自由基清除劑”，并展開(kāi)了各種清除自由基的實(shí)驗(yàn)研究[8-10]。

生姜是典型的藥食同源性植物，為姜科植物姜的新鮮根莖，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳之功效[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明生姜具有抗氧化、改善脂質(zhì)代謝、降血脂、改善心腦血管系統(tǒng)、防輻射、抗炎、抗微生物、抗腫瘤、降血糖等作用[12]。生姜油樹(shù)脂是指通過(guò)有機(jī)溶劑從姜根莖中萃取出來(lái)的深琥珀色至深棕色的黏稠液體，一般通過(guò)溶劑浸提法、壓榨法和超臨界CO2流體萃取法萃取。生姜油樹(shù)脂具有很多的功能特性，如開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑、開(kāi)發(fā)天然抗菌劑、醫(yī)藥和保健品等[13]。鄭君成等[14]通過(guò)GC-MS分析了生姜油樹(shù)脂的成分，鑒定出76種化合物，烯烴類(lèi)易揮發(fā)性化合物相對(duì)含量達(dá)56.66%，姜辣素相對(duì)含量達(dá)到33.95%。生姜油樹(shù)脂中的姜辣素，其各組分物質(zhì)分子中均含有創(chuàng)木酚基結(jié)構(gòu)，在常溫下為黏稠液體，具有很強(qiáng)的抗氧化性，是一種有效的自由基清除劑。Singh等[15]通過(guò)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）、硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid，TBA）等方法研究生姜油樹(shù)脂對(duì)芥子油的抗氧化效果；葛慶豐等[16]采用順磁共振法測(cè)定姜油樹(shù)脂對(duì)DPPH自由基的清除率，均表明生姜油樹(shù)脂具有很強(qiáng)的抗氧化性。但目前對(duì)于生姜油樹(shù)脂抗氧化性的研究?jī)H局限于化學(xué)水平，未深入到細(xì)胞水平。

因此，本研究通過(guò)建立RAW264.7的過(guò)氧化氫損傷模型，研究不同濃度生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫所引起的氧化損傷的保護(hù)作用，為開(kāi)發(fā)天然抗氧化應(yīng)激中藥添加劑提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生姜油樹(shù)脂，本實(shí)驗(yàn)室制備。生姜烘干后磨粉過(guò)篩，利用超臨界CO2流體從姜粉中萃取。生姜油樹(shù)脂經(jīng)0.45 ?m濾膜過(guò)濾后于4℃保存。

MDA、SOD、GSH、GSH-Px以及BCA（bicin choninic acid）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程公司；噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Sigma公司；DMEM（dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、雙抗（青霉素與鏈霉素） 美國(guó)Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HA 121-50-01超臨界萃取裝置 江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；AL 104電子天平 上海精天電子儀器有限公司；Coster 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司；SPECTRA MAX plus酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；SW-CJ-IF超凈工作臺(tái) 美國(guó)Biological Coporation公司；HEPA Class100細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；BX-50顯微鏡 日本Olympus公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的RAW264.7細(xì)胞株接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底70%～80%時(shí)，用1 mL胰酶細(xì)胞消化液消化1 min左右，按1∶3傳代，培養(yǎng)3代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 RAW264.7過(guò)氧化氫損傷模型的建立

過(guò)氧化氫是一種重要的活性氧，外源性過(guò)氧化氫易通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)過(guò)渡金屬存在時(shí)通過(guò)Fenton反應(yīng)，形成高活性的自由基，進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷[6]。因其操作簡(jiǎn)單，容易控制，常用于體外模擬細(xì)胞的過(guò)氧化損傷實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，用胰酶細(xì)胞消化液消化后加入DMEM完全培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.0×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔200 ?L，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入用DMEM完全培養(yǎng)基配制的過(guò)氧化氫溶液，過(guò)氧化氫溶液的最終濃度分別為0（空白組）、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，并用PBS洗滌3次后加入200 ?L DMEM完全培養(yǎng)基，每孔再加入10 ?L質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，再加入150 ?L DMSO，輕輕振蕩使紫色結(jié)晶溶解，室溫反應(yīng)10 min后用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，并通過(guò)公式（1）計(jì)算過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞RAW264.7的抑制率。

式中：A0為過(guò)氧化氫空白組的平均吸光度；A1為特定濃度過(guò)氧化氫組的平均吸光度。

1.3.3 生姜油樹(shù)脂劑量篩選

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程同1.3.2節(jié)，僅將1.3.2節(jié)所加入的DMEM完全培養(yǎng)基配制的過(guò)氧化氫溶液換成DMEM完全培養(yǎng)基配制的生姜油樹(shù)脂溶液，生姜油樹(shù)脂溶液的最終質(zhì)量濃度分別為0（空白組）、1、2.5、5、10、15、20、25、50 ?g/mL。并通過(guò)公式（2）計(jì)算生姜油樹(shù)脂對(duì)細(xì)胞RAW264.7的抑制率。

式中：A0油為生姜油樹(shù)脂空白組的平均吸光度；A1油為生姜油樹(shù)脂樣品組的平均吸光度。

1.3.4 不同質(zhì)量濃度的生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫處理下RAW264.7細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、GSH含量，SOD以及GSH-Px活力的測(cè)定

將10 mL含有2.0×105個(gè)/mL RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至貼壁，棄上清，將貼壁細(xì)胞隨機(jī)分為6組，添加不同成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)，如表1。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液分離。其中細(xì)胞培養(yǎng)液于4℃、1 500 r/min離心5 min后取上清液待測(cè)；細(xì)胞用PBS清洗細(xì)胞3次后，于4℃、1 000 r/min離心10 min后，留細(xì)胞沉淀，再加入PBS，冰水浴條件下超聲破碎（功率300 W，5 s/次，間隔30 s，重復(fù)3次）。采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的MDA、GSH、SOD、GSH-Px以及BCA試劑盒測(cè)定。細(xì)胞內(nèi)的MDA、GSH含量，SOD及GSH-Px活力的計(jì)算以蛋白質(zhì)含量為基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照BCA試劑盒方法所測(cè)定。

表1 RAW264.7細(xì)胞分組及處理Table 1 Grouping and treatment of RAW 264.7 cells

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。組間比較采用最小顯著性差異（the least significant difference，LSD）檢驗(yàn)，P＜0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

篩選過(guò)氧化氫劑量的條件是與對(duì)照組比較不能對(duì)RAW264.7的正常生長(zhǎng)構(gòu)成影響。由圖1可知，與空白組相比，0.2 mmol/L過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響（P＞0.05），但高于0.3 mmol/L時(shí)均顯著抑制RAW264.7細(xì)胞增殖（P＜0.05）?？紤]到0.1 mmol/L的過(guò)氧化氫溶液濃度過(guò)小，對(duì)細(xì)胞造成的氧化性損傷不明顯，所以選擇0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫作為損傷條件，建立過(guò)氧化氫損傷模型，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 1 不同濃度過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Dose-dependent effects of hydrogen peroxide on the viability of RAW 264.7 cells

2.2 不同質(zhì)量濃度的生姜油樹(shù)脂對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度生姜油樹(shù)脂對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Dose-dependent effects of ginger oleoresin on the viability of RAW 264.7 cells

由圖2可知，與空白組相比，5 ?g/mL生姜油樹(shù)脂對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響（P＞0.05），但高于10 ?g/mL時(shí)均顯著抑制RAW264.7細(xì)胞增殖（P＜0.05）。因此，將生姜油樹(shù)脂的劑量確定為1、3、5 ?g/mL。將此質(zhì)量濃度作為推薦劑量進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的生物標(biāo)記物之一，幾十年來(lái)一直被國(guó)內(nèi)外學(xué)者用來(lái)反映脂質(zhì)過(guò)氧化的水平[17]。如圖3所示，與空白組相比，用0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫處理時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量顯著增加，而5 μg/mL生姜油樹(shù)脂單獨(dú)處理RAW264.7細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量無(wú)顯著影響，而添加1、3、5 μg/mL的生姜油樹(shù)脂的聯(lián)合處理組顯著抑制了過(guò)氧化氫所引起的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的增加，并呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。

圖3 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.77細(xì)胞（A）和細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中MDA含量的影響Fig.3 Individual and combined effects of ginger oleoresin and hydrogen peroxide on MDA levels in RAW 264.7 cells (A) and culture medium (B)

2.4 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW 264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量的影響

GSH作為體內(nèi)主要的生物抗氧劑和自由基清除劑，在維持體內(nèi)正常的氧化狀態(tài)和抗氧化防御機(jī)制中起著重要的作用[18]。如圖4所示，與空白組相比，用0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫處理時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量顯著降低，而5 μg/mL生姜油樹(shù)脂單獨(dú)處理RAW264.7細(xì)胞時(shí)細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量顯著增加，而添加1、3、5 μg/mL的生姜油樹(shù)脂的聯(lián)合處理組顯著抑制了過(guò)氧化氫所引起的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量的減少，并呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。

圖4 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.77細(xì)胞（A）和細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中GSH含量的影響Fig.4 Individual and combined effects of ginger oleoresin and hydrogen peroxide on GSH levels in RAW 264.7 cell (A) and cell-culture medium (B)

2.5 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性的影響

圖5 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.77細(xì)胞（A）和細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中SOD活性的影響Fig.5 Individual and combined effects of ginger oleoresin and hydrogen peroxide on SOD activities in RAW 264.7 cell (A) and cellculture medium (B)

抗氧化酶SOD在維持機(jī)體的氧化平衡中起著至關(guān)重要的作用，SOD活性高低可反映組織清除自由基能力[19]。如圖5所示，與空白組相比，用0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫處理時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD活性顯著降低，而5 μg/mL生姜油樹(shù)脂單獨(dú)處理RAW264.7細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD活性無(wú)顯著影響，而添加1、3、5 μg/mL的生姜油樹(shù)脂的聯(lián)合處理組顯著抑制了過(guò)氧化氫所引起的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性的下降，并呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。

2.6 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的影響

圖6 生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.77細(xì)胞（A）和細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中GSH-Px活性的影響Fig.6 Individual and combined effects of ginger oleoresin and hydrogen peroxide on GSH-Px activities in RAW 264.7 cell (A) and cellculture medium (B)

GSH-Px能夠有效的清除脂質(zhì)和其他的有機(jī)的氫過(guò)氧化物，是低水平的氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用的重要酶[20]。如圖6所示，與空白組相比，用0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫處理時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH-Px活性顯著降低 而5 μg/mL生姜油樹(shù)脂單獨(dú)處理RAW264.7細(xì)胞時(shí)對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH-Px活性無(wú)顯著影響，而添加1、3、5 μg/mL的生姜油樹(shù)脂的聯(lián)合處理組顯著抑制了過(guò)氧化氫所引起的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的下降，并呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

自由基對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害作用是引起生物膜上多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，生成大量髓過(guò)氧化物酶。由于MDA是髓過(guò)氧化物酶穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物，所以常用來(lái)反映組織脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度[21]。GSH能夠直接或者通過(guò)酶促反應(yīng)間接的清除自由基[22]，并且也參與了GSH-Px催化H2O2生成H2O的反應(yīng)[23]。SOD和GSH-Px是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，其中SOD通過(guò)歧化反應(yīng)清除氧自由基[24]。GSH-Px通過(guò)催化GSH還原一系列的氫過(guò)氧化物發(fā)揮作用清除氧自由基[25]。因此，測(cè)定MDA、GSH含量以及SOD、GSH-Px活性不僅可以反映細(xì)胞損傷的原因，還可以判斷細(xì)胞損傷的程度。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)氧化氫處理后，RAW264.7巨噬細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量均顯著升高、GSH含量以及SOD、GSH-Px活性顯著下降，這表明過(guò)氧化氫對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞具有明顯的毒性作用。而用不同濃度生姜油樹(shù)脂和過(guò)氧化氫聯(lián)合處理組，上述抗氧化性指標(biāo)較過(guò)氧化氫損傷組獲得不同程度的改善。生姜油樹(shù)脂可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量，提高清除自由基的能力，防止生物膜磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成過(guò)氧化脂質(zhì)，保持生物膜的結(jié)構(gòu)完整和膜表面蛋白質(zhì)的功能，從而保護(hù)細(xì)胞不受過(guò)氧化氫的氧化損傷；通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)MDA含量，減輕細(xì)胞膜、線(xiàn)粒體膜和磷脂膜等受氧自由基攻擊后的損傷程度，從而間接增強(qiáng)了細(xì)胞清除氧自由基的能力，使脂質(zhì)過(guò)氧化程度降低，有效地保護(hù)了RAW 264.7細(xì)胞。生姜油樹(shù)脂通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)，有效地清除了自由基，提高抗氧化能力，從而對(duì)過(guò)氧化氫所引起的RAW264.7的氧化性損傷起到保護(hù)作用。

通過(guò)建立RAW264.7細(xì)胞的過(guò)氧化氫損傷模型，確定0.2 mmol/L的過(guò)氧化氫能使RAW264.7細(xì)胞抗氧化機(jī)能受損；研究了生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起的RAW264.7細(xì)胞損傷的影響，可知生姜油樹(shù)脂可以延緩0.2 mmol/L過(guò)氧化氫引起的RAW264.7細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量升高、GSH含量以及SOD、GSH-Px活性顯著下降，表明生姜油樹(shù)脂對(duì)過(guò)氧化氫引起的RAW264.7細(xì)胞的氧化性損傷具有保護(hù)作用，并呈劑量依賴(lài)性。

[1] 李宜培. 線(xiàn)粒體損傷與細(xì)胞凋亡[J]. 河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 20(1): 94-97.

[2] PLAZA L, CRESPO I, de PASCUAL-TERESA S, et al. Impact of minimal processing on orange bioactive compounds during refrigerated storage[J]. Food Chemistry, 2011, 124: 646-651.

[3] HUANG Renhua, XIA Renxue, HU Liming, et al. Antioxidant activity and oxygen-scavenging system in orange pulp during fruit ripening and maturation[J]. Scientia Horticuvlturae, 2007, 113: 166-172.

[4] JO S H, SON M K, KOH H J, et al. Control of mitochondrial redox balance and cellular defense against oxidative damage by mitochondrial NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(19): 16168-16176.

[5] LIAO Hui, BANBURY L K. Antioxidant activity of 45 Chinese herbs and the relationship with their TCM characteristics[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2008, 5(4): 429-434.

[6] 張健, 魏欣冰, 丁華, 等. 卡維地洛對(duì)過(guò)氧化氫致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(5): 620-624.

[7] JU Hengyin, CHEN Shiuching, WU Kuojen, et al. Antioxidant phenolic profile from ethyl acetate fraction of Fructus Ligustri Lucidi with protection against hydrogen peroxide-induced oxidative damage in SHSY5Y cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50: 492-502.

[8] 郅潔, 李炳奇, 廉宜君, 等. 沙棗多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].中成藥, 2009, 31(5): 796-798.

[9] 戴喜末, 熊子文, 羅麗萍. 響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8): 93-97.

[10] 劉寧, 仇農(nóng)學(xué), 田玉霞. 超聲輔助提取紫蘇葉黃酮及其清除自由基作用研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 23(1): 158-161.

[11] 郭琪, 李翔, 雷虹, 等. 姜及其制劑抗嘔吐作用的研究進(jìn)展[J]. 解放軍醫(yī)藥雜志, 2013, 25(2): 54-56.

[12] 胡煒彥, 張榮平, 唐麗萍, 等. 生姜化學(xué)和藥理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2008, 17(9): 10-14.

[13] 徐勇, 梁麗敏, 寇秀穎, 等. 姜油樹(shù)脂的抗氧化活性研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2010, 31(6): 32-34.

[14] 鄭君成, 高兆建, 劉輝, 等. 姜油樹(shù)脂的超臨界CO2萃取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(18): 163-167.

[15] SINGH G, KAPOOR I P S, SINGH P, et al. Chemistry, antioxidant and antimicrobial investigations on essential oil and oleoresins of Zingiber officinale[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46: 3295-3302.

[16] 葛慶豐, 宋明軍, 顧林. 順磁共振測(cè)定姜油樹(shù)脂的DPPH自由基清除率[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(15): 121-125.

[17] LYKKESFELDT J. Malondialdehyde as biomarker of oxidative damage to lipids caused by smoking[J]. Clinica Chimica Acta, 2007, 380(1/2): 50-58.

[18] 張偉, 楊震國(guó), 候永清, 等. N-乙酰半胱氨酸對(duì)脂多糖刺激仔豬腸黏膜抗氧化能力的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2011, 23(4): 842-847.

[19] 黃清萍, 余薇. 黃芪注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺氧的抗氧化作用[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 21(3): 193-195.

[20] MATéS J M, PéREZ-GóMEZ C, ND?EZ de CASTRO I. Antioxidant enzymes and human diseases[J]. Clinical Biochemistry, 1999, 32(8): 595-603.

[21] 余薇, 吳基良, 汪暉, 等. 大蒜多糖對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2005, 21(1): 96-99.

[22] FANG Yunzhong, YANG Sheng, WU Guoyao. Free radicals, antioxidants, and nutrition[J]. Nutrition, 2002, 18(10): 872-879.

[23] LEI Xingen. in vivo antioxidant role of glutathione peroxidase: evidence from knockout mice[J]. Methods in Enzymology, 2002, 347: 213-225.

[24] 陳大春, 修梅紅, 王寧. 利培酮對(duì)精深分裂癥首次發(fā)病患者超氧化物歧化酶和丙二醛及S100B蛋白的影響[J]. 中華精神科雜志, 2010, 43(1): 19-23.

[25] 徐俊吉, 呂士杰, 魏景艷. 含硒抗體模擬谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的研究進(jìn)展[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 31(4): 220-223.

Protective Effects of Ginger Oleoresin on Hydrogen Peroxide-Induced Toxicity in Cultured RAW 264.7 Cells

BIAN Meng-yao1, FANG Yong2, PEI Fei1, ZHAO Li-yan1, XIN Zhi-hong1, AN Xin-xin1, YANG Fang-mei1, HU Qiu-hui1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210046, China)

Objective: To study the protective effects of ginger oleoresin on alleviating oxidative damage induced by hydrogen peroxide (H2O2) in RAW 264.7 cells. Methods: A cell model of oxidative damage was established by H2O2treatment. RAW 264.7 cells were treated with different concentrations of ginger oleoresin plus H2O2(0.2 mmol/L). Malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in these cell and culture medium were measured. Results: Ginger oleoresin with different concentrations significantly attenuated the oxidative damage induced by H2O2. in these cells. Ginger oleoresin decreased the MDA content, increased the GSH content and the activity of SOD and GSH-Px in a dose-dependent manner with the optimal concentration being 5 μg/mL. Conclusion: Ginger oleoresin has protective effects on H2O2-induced injury in RAW 264.7 cells by up-regulating cellular redox system and reducing the level of free radicals.

ginger oleoresin; RAW 264.7; hydrogen peroxide; antioxidant capacity

TS201.2

A

1002-6630(2014)01-0244-06

10.7506/spkx1002-6630-201323048

2013-09-25

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（200903018）

卞夢(mèng)瑤（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：kuangdabmy@126.com

*通信作者：胡秋輝（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：qiuhuihu@njau.edu.cn