唐忠艷 姜 薇 李秀明 黃秋思 趙?；?賴 紅＊

（1中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，沈陽110001；2沈陽市渾南新區(qū)婦產(chǎn)科，遼寧110180）

近年來由于惡性腫瘤的年輕化趨勢，免疫性疾病好發(fā)于年輕女性以及化療后患者存活率不斷提高等現(xiàn)象，使化療所致卵巢早衰成為臨床關(guān)注的熱點［1］?；煂β殉灿袊乐負p害，烷化劑較易引起卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）［2］。婦女卵巢早衰后，由于卵泡閉鎖，卵泡數(shù)量的急劇減少，導(dǎo)致卵巢功能急劇減退。如果補充體內(nèi)缺失的雌激素可明顯改善卵巢早衰的癥狀，激素替代療法雖然臨床療效確切，但其副作用較大，使其應(yīng)用受到一定的限制。

人參作為傳統(tǒng)的抗衰老藥物，其有效活性成分是人參皂甙（ginsenoside，GS），GS由幾十種單體成分組成，其中人參皂甙Rb1的含量高、作用廣、活性強。在美國將人參作為能減輕絕經(jīng)期癥狀的中草藥被推薦使用，現(xiàn)已證實Rb1具有雌激素樣活性。但是國內(nèi)外對人參皂甙Rb1在婦產(chǎn)科疾病方面的研究較少，關(guān)于人參皂甙Rb1對化療致卵巢早衰大鼠卵泡顆粒細胞Bcl－2及Bax蛋白表達影響的研究尚未見文獻報道。因此，本研究擬采用免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法探討化療致卵巢早衰大鼠Bcl－2和Bax的蛋白表達，同時探討人參皂甙Rb1對卵巢保護作用，為卵巢早衰患者的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1．實驗動物及分組

選用中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供的雌性2－3月齡，體重200±20g，具有正常動情周期的wistar大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組，每組10只：①對照組：不施加任何處理因素；②模型組：腹腔注射環(huán)磷酰胺負荷劑量50mg／kg，以8mg／kg／d的維持劑量連續(xù)注射14d，之后給予等劑量的生理鹽水灌胃，連續(xù)4周；③治療組：造模成功后，給予人參皂甙 Rb1 25mg／kg／d灌胃，連續(xù)4周。

2．主要試劑與儀器

Bcl－2抗體、Bax抗體（北京博奧森公司），F(xiàn)SH、E2放免試劑盒（北京博奧森公司），全蛋白提取試劑盒（凱基公司），冰凍切片機（leitz，德國），凝膠成像儀、電泳儀（上海天能科技有限公司），康氏振蕩器（KS－Ⅱoscillator），高速臺式冷凍離心機（TGl－16）。

3．灌流及取材

各組大鼠用10%水合氯醛3．5ml／kg腹腔注射麻醉后，開胸暴露心臟，左心室插管，灌注生理鹽水約150ml后，再灌注4%多聚甲醛（0．1MPB，pH 7．4）250ml，持續(xù)30min后立即取卵巢，卵巢組織在相同緩沖液中后固定3－24h，經(jīng)30%蔗糖緩沖液48h，OCT包埋，行恒冷箱冰凍切片。

4．免疫組織化學(xué)染色方法

卵巢組織6μm厚連續(xù)切片。采用SABC法行免疫組化染色，卵巢組織切片常溫干燥，30%H2O220ml加蒸餾水200ml混合，室溫10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗5min×3次；用微波爐進行熱修復(fù)抗原后；用5%BSA封閉液室溫封閉30min；分別滴加Bcl－2和Bax一抗（1∶200）4℃過夜；翌日，室溫下滴加生物素化山羊抗兔IgG作用10min，再滴加SABC作用30min；DAB顯色3－10min，蘇木素復(fù)染，自來水返藍15min；常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

5．Western blot方法

每組各取4只大鼠頸椎脫臼處死、斷頭、剝離并取出雙側(cè)卵巢，將其剪碎加入0．5ml裂解液，冰上放置30min勻漿，4℃12000g／min低溫離心30min，取上清。BCA法進行蛋白定量，計算樣品蛋白濃度。加上樣緩沖液，水浴煮沸5min，冰上冷卻。等量上樣后進行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳行，4%濃縮膠（80v，30min），12%分離膠（120v，50min），然后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上（60v，2h），5%脫脂奶粉（用 TTBS配制）室溫封閉1h，分別加一抗Bcl－2和Bax抗體（1∶200）和β－actin抗體（1∶200）4℃冰箱過夜，TTBS洗膜10min×3次，分別與辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗：山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG（1∶5000）室溫下孵育1h，TTBS洗膜10min×3次，將PVDF膜置于保鮮膜上，A、B發(fā)光液按1∶1比例混合，滴加A、B混合液，進行發(fā)光，經(jīng)凝膠自動分析成像系統(tǒng)進行成像，圖像采集和分析。

6．統(tǒng)計學(xué)分析

以上所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS11．5軟件單因素方差分析進行組間比較。P＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0．01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．卵巢顆粒細胞Bax蛋白的表達

免疫組化SABC法鏡下觀察到卵巢組織內(nèi)的Bax陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色細顆粒狀，主要積聚在卵巢的顆粒細胞層。高倍鏡下可見Bax蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物主要表達在顆粒細胞胞漿，經(jīng)蘇木素復(fù)染后細胞核呈淡藍色，核仁清晰。對照組大鼠卵巢顆粒細胞Bax蛋白表達的陽性產(chǎn)物染色較淺；模型組Bax蛋白表達的陽性反應(yīng)產(chǎn)物最深，模型組與對照組相比P＜0．05有差異；而治療組與模型組比較Bax蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物較淺，經(jīng)分析其差異有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0．05（表1，圖1A、B、C）。

表1 各組卵巢早衰大鼠Bax、Bcl－2蛋白的表達±s，IOD）Table 1 The Bcl－2and Bax protein expression in POF rat ovary（ˉx±s，IOD）

表1 各組卵巢早衰大鼠Bax、Bcl－2蛋白的表達±s，IOD）Table 1 The Bcl－2and Bax protein expression in POF rat ovary（ˉx±s，IOD）

＊Compared with control，P＜0．05；▲Compared with Model group，P＜0．05

Groups Bax（IOD） Bcl－2（IOD）Control 0．2090±0．00512 0．2424±0．01270 Model 0．2250±0．00860＊ 0．2278±0．01098＊Treatment 0．2172±0．00787▲ 0．2363±0．00457▲

2．卵巢顆粒細胞Bcl－2蛋白的表達

抑凋亡因子Bcl－2蛋白主要表達于卵巢顆粒細胞漿中，多以棕色、棕黃色為主。從表1可以看出，模型組大鼠卵巢顆粒細胞Bcl－2蛋白表達最低，明顯低于對照組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。Rb1給藥后的治療組可上調(diào)環(huán)磷酰胺所致卵巢早衰大鼠卵巢顆粒細胞Bcl－2蛋白的表達，與模型組比較其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0．05（表1，圖2A、B、C）。

圖1 各組大鼠卵巢Bax蛋白的表達與分布。A對照組：顆粒細胞陽性反應(yīng)物棕褐色顆粒最淺，表達最少；B模型組：顆粒最深，表達最多；C治療組：顆粒較淺并接近對照組，SABC法 ×400Fig．1The Bcl－2protein expression in POF rat ovary，The positive control group（A）granulosa cell reactant brown granules most shallow，expressing at least；model group（B）deepest expression up；treatment group（C）shallow and close to the control group，SABC×400

圖2 各組大鼠卵巢Bcl－2蛋白的表達與分布。A對照組：顆粒細胞陽性反應(yīng)物棕褐色顆粒最深，表達最多；B模型組：顆粒最淺，表達最少；C治療組：顆粒較深，Bcl－2蛋白的表達明顯增多，SABC法 ×400Fig．2The Bcl－2protein expression in POF rat ovary，The positive control group（A）granulosa cell reactant brown granules deepest expression up；model group（B）most shallow，expressing at least；deeper treatment group，（C）Bcl－2protein expression was significantly increased，SABC×400

3．Western blot檢測卵巢顆粒細胞 Bcl－2和Bax的表達

各組大鼠卵巢顆粒細胞的Western blot結(jié)果如圖1所示，在相對分子量為21kDa處有一清晰的Bax蛋白和26kDa Bcl－2蛋白條帶，以43kDaβ－actin為內(nèi)參采用IOD半定量法進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示對照組，模型組和治療組3組間Bax蛋白之間的表達均有差異，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；Bcl－2蛋白治療組與模型組相比表達上調(diào)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05，表2）

表2 各組大鼠Bcl－2和Bax蛋白與β－actin比較±s，IOD）Table 2 The comparation between Bcl－2and Bax protein expression withβ－actin in rats

表2 各組大鼠Bcl－2和Bax蛋白與β－actin比較±s，IOD）Table 2 The comparation between Bcl－2and Bax protein expression withβ－actin in rats

＊Compared with control，P＜0．05；▲Compared with Model group，P＜0．05

Groups Bax Bcl－2 Control 0．60±0．056 0．54±0．080 Model 1．12±0．073▲ 0．50±0．055▲Treatment 0．99±0．048＊ 0．53±0．086＊

圖3 N：對照組；E：模型組D：治療組Fig．3N：Control group E：Model group D：Treatment group

討 論

POF是由多種病因及復(fù)雜機制引起的多基因疾病［3］?；熕幬飼?dǎo)致卵巢的各種不利影響，包括卵巢早衰及不孕［4］。POF的發(fā)生主要原因是卵泡閉鎖加速，卵泡閉鎖實際上是卵巢顆粒細胞及卵母細胞的凋亡。參與細胞凋亡調(diào)控的重要基因有很多種，其中Bcl－2和Bax基因?qū)κ箢惵殉差w粒細胞凋亡起決定性作用［5］。一般認為Bcl－2基因通過抗細胞凋亡在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。Bcl－2可防止或延遲由多種化療藥物所誘導(dǎo)的細胞凋亡。

顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的主要機制［6－8］，因此，對顆粒細胞凋亡的研究越來越受到人們的重視。細胞是否發(fā)生凋亡與凋亡抑制因子和凋亡活化因子之間的平衡密切相關(guān)，其中重要的有凋亡抑制因子Bcl－2和凋亡活化因子Bax等。Bcl－2基因及其表達蛋白可明顯延長細胞的存活時間，Bcl－2基因位于18q21上約230kb。該基因有3個外顯子和2個啟動子，指導(dǎo)Bcl－2蛋白合成。Bcl－2蛋白是一個線粒體外膜蛋白，其C端由19個氨基酸組成的疏水段使Bcl－2蛋白可以鉚釘于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上，可能在核膜的運輸，核微孔復(fù)合物的形成和核膜的維持等方面其重要作用［9－10］。Bax與 Bcl－2基因具有40%的同源性，位于19號染色體，長約4．5kb有6個外顯子，指導(dǎo)Bax蛋白的合成。Bax增高，促進細胞凋亡；Bcl－2增高，抑制細胞凋亡，Bcl－2與Bax的相互作用是其中心環(huán)節(jié)。Bax不僅能和Bcl－2形成異源二聚體（Bcl－2／Bax）抑制凋亡，而且其自身還能形成同源二聚體（Bax／Bax）誘導(dǎo)凋亡，Bcl－2／Bax和Bax／Bax比率的改變是細胞凋亡的決定因素［11－12］。

本實驗結(jié)果表明，模型組卵巢顆粒細胞Bcl－2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，Bcl－2／Bax比值明顯減小，給予人參皂甙Rb1后卵巢顆粒細胞Bcl－2／Bax比值明顯升高，說明Rb1可調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax的表達而抑制顆粒細胞凋亡，而對化療后卵巢早衰大鼠的卵巢起到一定的保護作用，本研究結(jié)果將為卵巢早衰患者的臨床治療提供新的治療思路。

［1］Meskhi A，Seif M W．Premature ovarian failure．Curr Opin Obstet Gynecol，2006，18 （4）：418－426

［2］Cohen LE．Cancer treatment and the ovary：the effects of chemotheraphy and radiation．Ann N Y AcadSc，2008，1 135：123－125

［3］陳蔚，雷小敏．卵巢早衰病因?qū)W研究進展．生殖與避孕，2004，24（1）：43－47

［4］Zhao XJ，Huang YH，Yu YC，et al．GnRH antagonist cetrorelix inhibits mitochondria－dependent apoptosis triggered by chemotherapy in granulosa cells of rats．Gynecol Oncol，2010，118（1）：69－75

［5］李潔，楊菁．卵巢早衰動物模型建立的研究進展．生殖與避孕，2006，26（9）：550－553

［6］Dokras A，Habana A，Graldo J，et al．Secretion of inhibin during ovarain stimulation is decreased in infertile women with endometriosis．Fertil Steril，2000，74（1）：35－40

［7］Shiota M，Sugai N，Tamura M，et al．Correlation of mitogen－activated protein kinase activities with cell survival and apoptosis in porcine granulosa cell．Zool Sci，2003，20（2）：193－201

［8］李莉，張三元．絕經(jīng)過渡期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡趨勢與INH－α亞單位表達的研究．中國藥物與臨床，2006，6（2）：116－118

［9］Reed JC．Bcl－2and the regulation of programmed cell death．J Cell Biol，1994，124（1）：1－6

［10］Murphy KM，Streips UN，Lock RB．Bcl－2inhibits a Fas induced conformational change in the Bas N terminus and Bax mitochondrial translocation．J Biol Chem，2000，275（23）：17225－17228

［11］Tranzi RE，Moir RD，Wagner SL．Clearance of Alzheimer＇s Abeta peptide：the many roads to perdition．Neuron，2004，43（5）：605－608

［12］Allen G，Barnard H，McColl R，et al．Reduced hippocampal functional connectivity in Alzheimer disease．Arch Neurol，2007，64（10）：1482－1487