陳江帆 姜海嬌 王秀茹 方長清 李建華

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科暨中國醫(yī)科大學(xué)病理教研室，沈陽110001）

缺氧在腫瘤生長過程中很常見，最近研究表明HIF－1在缺氧刺激腫瘤生長過程中具有重要作用。生化分析表明HIF－1是一類由α亞基和β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF－1α是HIF－1的氧調(diào)節(jié)亞基，氧主要通過該亞基來調(diào)節(jié)HIF－1的生物活性。HIF－1β對氧的依賴性弱，但對 HIF－1是不可缺少的，只有兩個亞基聚合形成共聚二聚體時才能形成有活性的 HIF－1［1］。本研究的目的是檢測HIF－1的兩種亞型 HIF－1α和 HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞中的表達(dá)，并分析它們之間的關(guān)系，探討HIF－1在肺非小細(xì)胞癌胸水缺氧適應(yīng)性調(diào)節(jié)中的作用。

材料和方法

1．臨床資料

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及病房患者胸腔積液標(biāo)本1060例，肺穿刺組織活檢標(biāo)本120例，其中男性患者720例，女性患者460例：年齡小于等于50歲者390例，大于40歲者790例，所有胸腔積液標(biāo)本全部經(jīng)臨床、CT、磁共振及組織病理學(xué)確診。

2．試劑

鼠抗人 HIF－1α（SC－53546）單克隆抗體購自美國Santa公司，鼠抗人 HIF－1β（ab54786）單克隆抗體購自英國abcam公司。CD34、VEGF鼠抗人單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，S－P超敏免疫組化試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

3．切片的制備

收集的1060例胸腔積液標(biāo)本采用液基細(xì)胞薄層方法（HOLOGIC TCT）常規(guī)制片、診斷后，經(jīng)95%乙醇固定后石蠟包埋、切片。每份標(biāo)本切片分別用做 HIF－1α、HIF－1β、CD34、VEGF免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

4．實驗方法

4．1液基細(xì)胞薄層檢測技術(shù)（HOLOGIC TCT

取50ml胸腔積液2000r／min離心5min后，棄上清液，加入50ml新柏氏細(xì)胞清洗液振蕩10－15min后2000r／min離心5min，棄上清吸取適量沉淀物加入新柏氏細(xì)胞保存瓶，靜置10min左右，用新柏氏液基細(xì)胞儀制成薄層細(xì)胞涂片，95%的酒精固定10min后巴氏染色。

4．2細(xì)胞塊制備方法

將存放十小時以上經(jīng)HOLOGIC TCT篩查結(jié)果為可疑瘤細(xì)胞或查到瘤細(xì)胞的剩余胸腔積液標(biāo)本2000r／min離心5min后，棄掉上清液，加入95%乙醇混勻后2000r／min離心5min固定2h以上后脫水石蠟包埋。

4．3免疫細(xì)胞及其免疫組織化學(xué)技術(shù)

1．NSCLC胸水中 HOLOGIC TCT和血管生成標(biāo)記物免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

我們首先通過液基薄層細(xì)胞涂片（HOLOGIC TCT）篩查，篩選出胸腔積液中有可疑瘤細(xì)胞及查到瘤細(xì)胞的標(biāo)本病例做石蠟細(xì)胞包埋切片，并進(jìn)一步做HE和免疫細(xì)胞化學(xué)染色（如圖1ABC所示）。

2．NSCLC胸水標(biāo)本和NSCLC穿刺組織切片中 HIF－1α 和 HIF－1β 免 疫 組 化 染 色 結(jié) 果 （如 圖1DEFGH所示）。

3HIF－1α在NSCLC穿刺組織和胸水標(biāo)本內(nèi)的陽性表達(dá)率分別為72．50%、17．55%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；HIF－1β在 NSCLC穿刺組織和胸水標(biāo)本內(nèi)的陽性表達(dá)率分別為77．50%、81．42%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。（如表1所示）

常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶法（streptavidin－peroxidase，S－P）進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色：切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化：0．01mol／L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)20min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷溶液37℃下孵育30min；非免疫性動物血清37℃下孵育40min；一 抗 4℃ 下 孵 育 過 夜，HIF－1α、HIF－1β、CD34、VEGF稀釋比例為1∶100．生物素標(biāo)記的二抗37℃下孵育30min；鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37℃下孵育30min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。各步之間用PBS（PH＝7．4）沖洗三次，每次5min。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性肺癌切片作陽性對照。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞，著色強度分為無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細(xì)胞數(shù)分為＜10%為0分，10%－50%為1分，＞50%為2分，兩項得分相乘結(jié)果＞2記為陽性（＋），＜2為陰性。

5．統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組數(shù)據(jù)的陽性率比較采用卡方檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Sperman等級相關(guān)分析判別HIF－1α與HIF－1β表達(dá)的相關(guān)性，HIF－1α與VEGF表達(dá)的相關(guān)性，HIF－1β與VEGF表達(dá)的相關(guān)性。

結(jié) 果

表1 1180例非小細(xì)胞肺癌中免疫細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)的表達(dá)Table 1 The expression of Immunocytochemistry in 1180cases non－small cell lung cancer

4．NSCLC胸水中HIF－1和VEGF的相關(guān)性分析：HIF－1α與 HIF－1β的表達(dá)呈正相關(guān)（見表2），HIF－1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（見表3），HIF－1β與VEGF的表達(dá)無相關(guān)性（見表4）。

表3 NSCLC胸水中HIF－1α表達(dá)與VEGF的相關(guān)性Table 3 The relationship between HIF－1αand VEGFexpressions in non－small cell lung cancer pleural effusion cells

表4 NSCLC胸水中HIF－1β表達(dá)與VEGF的相關(guān)性Table 4 The relationship between HIF－1β and VEGF expressions in non－small cell lung cancer pleural effusion cells

討 論

NSCLC是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，惡性腫瘤在生長過程中，由于組織生長過快會造成局部嚴(yán)重缺氧。HIF－1是由semenza等于1992年在缺氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，由120kD的α亞單位（HIF－1α）與91～94kD的β亞單位（HIF－1β）組成［2］。HIF－1α只在缺氧細(xì)胞核中表達(dá)，與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，HIF－1β為 HIF－1的輔助調(diào)節(jié)亞基，國內(nèi)針對 HIF－1β研究報道較少［3］。Marxsne等［4］對皮膚癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等分別作了分析，發(fā)現(xiàn)在這些癌組織中HIF－1α過表達(dá)，且在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤的邊緣，HIF－1α表達(dá)明顯增多，而在腫瘤組織內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞和鄰近的正常組織則未見HIF－1α 的 表 達(dá)。 本 研 究 結(jié) 果 表 明，HIF－1α 在NSCLC胸水標(biāo)本和穿刺組織中陽性表達(dá)率具有明顯差異，這可能與惡性胸水腫瘤細(xì)胞數(shù)量以及所處的缺氧微環(huán)境與腫瘤組織之間的差異有關(guān)。

實體瘤的進(jìn)行性生長依賴于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管網(wǎng)的建立。許多直接、間接的證據(jù)已經(jīng)證明，腫瘤生長是依賴血管的［5－6］。血管形成確保了腫瘤代謝的進(jìn)行，對腫瘤增殖必不可少。本研究表明，離體NSCLC胸水腫瘤細(xì)胞在缺少氧氣和營養(yǎng)的條件下，可以分化為腫瘤細(xì)胞血管樣結(jié)構(gòu)，由于惡性胸水脫落細(xì)胞中只存在上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，無內(nèi)皮細(xì)胞，通過CD34和VEGF免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實了在NSCLC胸水中存在著腫瘤血管生成。通過相關(guān)性分析證實 HIF－1α和 HIF－1β、VEGF表達(dá)之間均存在一定的正相關(guān)關(guān)系，目前研究表明，在缺氧調(diào)節(jié)信號通路中，VEGF為HIF－1和腫瘤血管生成之間的重要樞紐。腫瘤細(xì)胞快速生長所造成的缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)HIF－1α的表達(dá)，而HIF－1α又可調(diào)節(jié)其下游基因VEGF的表達(dá)而促進(jìn)血管形成和腫瘤的生長［7－8］。

總之，HIF－1與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤等過程密切相關(guān)。HIF－1α可能是調(diào)控與腫瘤血管生長密切相關(guān)基因的上游基因，因此對HIF－1的研究和調(diào)控在抑制腫瘤組織生長及其血管形成方面具有廣闊的前景和價值，勢必將成為今后抗腫瘤治療的新靶點。而HIF－1α和VEGF的相互影響和促進(jìn)的關(guān)系，為今后使用VEGF抑制劑協(xié)同治療腫瘤提供了有力的依據(jù)。

圖 版 說 明

圖1A 胸水中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HE染色×400；

圖1B CD34在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)（S－P）×400；

圖1C VEGF在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)（SP）×400；

圖1D HIF－1α在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞核中陽性表達(dá)（SP）×400；

圖1E HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌胸水細(xì)胞質(zhì)中陽性表達(dá)（SP）×400；

圖1F 非小細(xì)胞肺癌穿刺組織HE染色×400；

圖1G HIF－1α在非小細(xì)胞肺癌穿刺組織中陽性表達(dá)（S－P）×400；

圖1H HIF－1β在非小細(xì)胞肺癌穿刺組織中陽性表達(dá)（S－P）×400；

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1ANon－small cell lung cancer cells of pleural effusion（HE）×400；

Fig．1BCD34positive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1CVEGF positive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1DHIF－1αpositive expression in the nucleus of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1EHIF－1βpositive expression in the cytoplasm of nonsmall cell lung cancer pleural effusion（S－P）×400；

Fig．1FNon－small cell lung cancer puncture organizations（HE）×400；

Fig．1GHIF－1αpositive expression in non－small cell lung cancer puncture organizations（S－P）×400；

Fig．1HHIF－1βpositive expression in non－small cell lung cancer puncture organizations（S－P）×400；

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