張振山 王春芳＊ 胡風(fēng)云 李鵬飛 張海濱 李 宵

（1山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，太原030001；2山西省人民醫(yī)院，太原030001；3山西醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心，太原030001）

干細(xì)胞移植在臨床上治療運動神經(jīng)元退行性疾病有著很好的應(yīng)用前景，為臨床治療脊髓損傷類疾病帶來了新的理念性革命［1］。作為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一類具有細(xì)胞來源廣、體外增殖能力強(qiáng)、免疫原性低且不存在倫理爭議的干細(xì)胞［2－3］，在體外已經(jīng)被成功誘導(dǎo)為軟骨、成骨、皮膚、神經(jīng)等多種細(xì)胞［4－5］。因此深入研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向向運動神經(jīng)元（motor neuron，MN）方向分化可以為神經(jīng)再生領(lǐng)域提供理想的種子細(xì)胞。Nestin為神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的特異性標(biāo)記物［6］，Hb9為運動神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物［7］，通過對該兩項基因的檢測，可以對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向運動神經(jīng)元分化的過程有更為清晰的認(rèn)識。本文旨在通過檢測Nestin與Hb9表達(dá)的變化來探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）在維甲酸（retinoic acod，RA）、音猬因子（sonic hedgehog，Shh）等因素的干預(yù)下向運動神經(jīng)元分化的過程，從而為運動神經(jīng)元最終走向臨床治療脊髓損傷提供更為詳盡的數(shù)據(jù)與理論支持。

材料和方法

1．主要試劑及儀器

DMEM 粉末（Gibco）、DMEM／F12（Gibco）、胎牛血清、六孔板，超凈工作臺，CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma），Stepone Plus PCR擴(kuò)增儀（ABI），倒置顯微鏡（OLYMPUS），熒光顯微鏡（OLYMPUS）

2．標(biāo)本來源

取自山西省人民醫(yī)院需骨髓穿刺但證實非血液病患者的骨髓血，且實驗已獲得經(jīng)患者本人或其家屬簽署的知情同意書。

3．hBMSC的分離培養(yǎng)及鑒定

取所抽取的骨髓血梯度離心后取中間層與少量培養(yǎng)基混勻，接種于六孔板內(nèi)貼壁4小時后加滿培養(yǎng)基，3天后全量換液，之后每3天換液逐步洗去未貼壁的紅細(xì)胞，并定期于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況及拍照。待細(xì)胞傳至第三代時，取生長狀況良好的一板細(xì)胞做CD44、CD45免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。

4．hBMSC分組誘導(dǎo)

取三板傳代至第三代的生長狀況良好的細(xì)胞分為三組。第一組為誘導(dǎo)分化組，將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基更換為不含胎牛血清，含RA濃度為5μmol／L的DMEM／F12培養(yǎng)基（輔助添加適當(dāng)濃度的bFGF、Shh因子）；第二組為自然分化組，將含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基更換為含1%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基；第三組為空白對照組，繼續(xù)使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。按照以上三組處理后繼續(xù)培養(yǎng)3天。

5．免疫細(xì)胞化學(xué)染色

取傳至第三代細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的六孔板中，取三板細(xì)胞按照以上分組處理并培養(yǎng)3天，0．01MPBS洗去培養(yǎng)基后4%多聚甲醛固定30分鐘，雙蒸水洗三次，0．3%Triton、山羊血清室溫條件下封閉30分鐘后分別各加入Nestin、Hb9小鼠抗人血清（Abcam，1∶100稀釋），4℃過夜后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（Abcam，1∶2000稀釋），室溫條件下孵育1．5小時，最后加 Hoechst 33342（invitrogen，1∶2000稀釋）染核30分鐘后熒光顯微鏡下觀察拍照。

6．檢測Nestin、Hb9基因表達(dá)

采用 Ambion miRNA Isolation Kit試劑并按照其試劑說明書提取以上三組的總RNA．逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含 RNA（100ng／μl）、Olig（dt）18Primer（50μM）、RNase free dH2O，70℃保溫10分鐘后冰上冷卻2分鐘以上，之后加入5×M－MLV Buffer，dNTP Mixture（10mM）、RNase Inhibitor（40U／μl）、RTase M－MLV（200U／μl），42℃保溫1小時，70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到的cDNA保存于－20℃以下的環(huán)境備用。引物采用 ABI Primer express3．0軟件設(shè)計，本實驗所涉及引物序列為：

Gene Primers sequences（5’－3’）Hb9 Forward：CCCACAGTGTTACCTGACTTATGAAA Reverse：GACCCCAGAGACGTAAGCATAAAC Nestin Forward：AGCCCTGACCACTCCAGTTTAG Reverse：CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTCTAC RPL－19Forward：TGGCAAGAAGAAGGTCTGGTTAG Reverse：GACGGGAGTTGGCATTGG

PCR擴(kuò)增采用 ABI Stepone Plus定量PCR儀，具體20μl反應(yīng)液組成為：SYBR Select Master Mix 10μl，PCR引物0．6μl，ddH2O 9μl，cDNA 產(chǎn)物0．4μl，每孔設(shè)置2個重復(fù)，以 RPL－19為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為：50℃2分鐘，95℃2分鐘，之后95℃15秒，58℃30秒，72℃1分鐘循環(huán)40次，分析采用比較CT值法，應(yīng)用 Applied Biosystems StepOneTMReal－Time PCR System Software所提供的 Study軟件進(jìn)行相對定量分析。

7．統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行t檢驗分析。

結(jié) 果

1．hBMSC形態(tài)學(xué)觀察及鑒定結(jié)果

原代培養(yǎng)3天后全量換液，可見少數(shù)呈梭形的單個貼壁細(xì)胞，分布不均勻，第二、三次換液可見原有的單個細(xì)胞逐漸集落生長，10天左右開始大量增多。傳代細(xì)胞生長更為迅速，分布均勻，形態(tài)纖長，細(xì)胞聚集到一定程度時可見漩渦狀。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，該梭形細(xì)胞99%以上為CD44陽性表達(dá)，CD45幾乎全為陰性表達(dá)。

2．不同分組的hBMSC形態(tài)學(xué)觀察

傳代至第三代的hBMSC經(jīng)RA誘導(dǎo)后，纖長的兩極明顯回縮，呈橢圓形或圓形細(xì)胞明顯增多，部分細(xì)胞可見有明顯的突起。自然分化組雖也有一定比例的此類細(xì)胞形成，但明顯低于誘導(dǎo)分化組?？瞻捉M未發(fā)現(xiàn)有顯著形態(tài)變化。

3．免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化組顯示的Nestin、Hb9陽性表達(dá)率均明顯高于其它兩組，其次表達(dá)率高的為自然分化組，空白組Nestin、Hb9陽性率表達(dá)均為最低。

4．PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線可知：三組細(xì)胞中，經(jīng)過RA、Shh誘導(dǎo)的hBMSC其Hb9、Nestin基因表達(dá)顯著增高，其次為自然分化組，空白對照組該基因表達(dá)為三組最低，且三組之間該兩種基因的表達(dá)均相互存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。

討 論

體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向運動神經(jīng)元分化已經(jīng)成為現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界研究的重大熱門，但其所存在的致瘤可能以及免疫排斥也幾乎成為制約運動神經(jīng)元最終走向臨床治療脊髓損傷類疾病的重大瓶頸［8－9］。相對于胚胎干細(xì)胞而言，非神經(jīng)源性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源廣泛且不存在倫理爭議、體外培養(yǎng)時增殖能力強(qiáng)、低免疫原性等多方面的優(yōu)點［10－11］。

Wislet－Gendebien S等通過研究認(rèn)為，BMSC向神經(jīng)元方向分化是一個逐步的過程，先是將其誘導(dǎo)為Nestin陽性的細(xì)胞，進(jìn)而將Nestin陽性的BMSC誘導(dǎo)為各類成熟的神經(jīng)元［12］。已有研究表明，RA可以與神經(jīng)營養(yǎng)因子－3（Neurotrophic factor－3，NT－3）聯(lián)合作用啟動 TrkC 的途徑促進(jìn)BMSC向 NSCs方向轉(zhuǎn)化［13］。

Shh作為三種分泌蛋白（Ihh，Dhh和Shh）家族中的一員，在神經(jīng)發(fā)育過程中起重要和關(guān)鍵性作用。Tanabe Y等通過研究發(fā)現(xiàn)，脊索分泌的Shh蛋白是誘導(dǎo)體內(nèi)MN分化的必需條件，由此推斷Shh信號通路參與了對體內(nèi) MN分化的管控［14］。據(jù)此我們推測出體外Shh可能有誘導(dǎo)BMSCs向膽堿能樣神經(jīng)元定向分化的作用。

Nestin是一種表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞的中間絲蛋白，在發(fā)育過程中逐漸被特定的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)絲代替，是神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，Hb9被選擇性表達(dá)在運動神經(jīng)元的形成過程中，Nakano T等的研究提到僅需增強(qiáng)小鼠Hb9基因中一個9－kb 5V片段的表達(dá)即可直接使其脊髓運動神經(jīng)元在體內(nèi)的表達(dá)大幅上調(diào)［7］，可以特異性地將其作為運動神經(jīng)元的標(biāo)記物。

實驗通過對Nestin與Hb9兩個基因的檢測重點探討了人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在RA及Shh的誘導(dǎo)下定向向神經(jīng)干細(xì)胞乃至運動神經(jīng)元分化的過程。通過探討以上分組中這兩個基因的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)，由于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所具有的多向分化能力，在正常未加任何誘導(dǎo)劑的情況下，有一定比例的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會自發(fā)向神經(jīng)干細(xì)胞乃至運動神經(jīng)元方向分化，但也正是因為其所具有的該干細(xì)胞特性，也可能有一定比例的hBMSC向其它方向發(fā)生了轉(zhuǎn)化，也就從側(cè)面證實了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的多向性。

其次，通過以上免疫細(xì)胞化學(xué)檢測及PCR結(jié)果可知，誘導(dǎo)分化組Nestin與Hb9的陽性表達(dá)率顯著高于自然分化組與空白對照組該兩項基因的表達(dá)率，由此可見，RA與Shh的誘導(dǎo)確實有效加強(qiáng)了hBMSC向神經(jīng)干細(xì)胞乃至運動神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的趨勢。

最后，通過僅對誘導(dǎo)分化組與空白組兩個組中Nestin、Hb9這兩個標(biāo)志性基因的比較來看，Nestin表達(dá)誘導(dǎo)組僅為空白組的5倍多（5．25），而Hb9表達(dá)誘導(dǎo)組已將近為空白組的120多倍（122）。結(jié)合BMSC向MN分化的階段性特征，可以推測，在Shh靶向作用的引導(dǎo)下，已經(jīng)有大量的hBMSC經(jīng)RA誘導(dǎo)為Nestin陽性的NSC后在Shh的輔助作用下又被誘導(dǎo)為Hb9陽性的MN。

在此需要提到的是，鄧鎮(zhèn)、姜曉丹等也曾用小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過不同分組處理后，采用SABC免疫細(xì)胞化學(xué)和間接免疫熒光法分別檢測了Nestin與Hb9的表達(dá)量［15］，所不同的是本實驗是通過直接分離并培養(yǎng)得到了人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在種屬來源方面與臨床運用的范疇具有一致性，可以直接為干細(xì)胞治療脊髓損傷類疾病提供可靠的細(xì)胞來源及數(shù)據(jù)支持。其次本實驗除運用免疫細(xì)胞化學(xué)這一在體檢測手段外，也進(jìn)一步運用了熒光定量PCR法檢測了兩個標(biāo)記基因，可能也正是由于檢測手段的不同，本實驗發(fā)現(xiàn)空白對照組及自然分化組也有少量的Hb9陽性表達(dá)，提示存在極少比例的hBMSC在未經(jīng)誘導(dǎo)的條件下自發(fā)向MN方向發(fā)生了分化。

綜上所述，我們的研究表明了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向神經(jīng)干細(xì)胞乃至運動神經(jīng)元分化的潛能，也進(jìn)一步證實了RA與Shh的誘導(dǎo)能夠有效促使hBMSC最終分化為運動神經(jīng)元的可行性。此次實驗研究有利于闡明hBMSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制，也提示我們今后可以通過施加RA與Shh對hBMSC的處理后，將其移植于脊髓損傷模型小鼠的受損部位，進(jìn)而從行為學(xué)上判斷運動神經(jīng)元比例增加后對模型小鼠功能恢復(fù)的改善作用，以期為hBMSC移植最終應(yīng)用于臨床上治療脊髓損傷類疾病提供更為全面的數(shù)據(jù)與實驗支持。

圖 版 說 明

圖1 第三代hBMSC CD44表達(dá)為陽性。A：細(xì)胞核用Hoechst33342染為藍(lán)色。B：綠色所示為CD44表達(dá)陽性細(xì)胞。

圖2 誘導(dǎo)分化組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞胞漿回縮，有神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)。A：誘導(dǎo)分化組細(xì)胞有神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn)。B：細(xì)胞胞漿回縮，伸出突起。

圖3 誘導(dǎo)分化組可見Nestin表達(dá)為陽性的細(xì)胞。A：細(xì)胞核用Hoechst33342染為藍(lán)色。B：綠色所示為Nestin表達(dá)陽性細(xì)胞。

圖4 Nestin與Hb9的PCR擴(kuò)增曲線。A：Nestin擴(kuò)增曲線（1：a Nestin；2：b Nestin；3：c Nestin；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）。B：Hb9擴(kuò)增曲線（1：a Hb9；2：b Hb9；3：c Hb9；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）。（a：誘導(dǎo)分化組；b：自然分化組；c：空白對照組）

圖5 Nestin與Hb9相對定量結(jié)果。A：Nestin相對定量結(jié)果（a：誘導(dǎo)分化組；b自然分化組；c：空白對照組）。B：Hb9相對定量結(jié)果（a：誘導(dǎo)分化組；b自然分化組；c：空白對照組）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The hBMSCs at passage three were immunoreactive to CD44．A：Cell nuclei were counterstained blue by Hoechst33342．B：CD44positive cells were green．

Fig 2The morphology of hBMSCs had changed in the differentiation group．The cell cytoplasm retracted，looked like neuron－like cells．A：The neuron－like cells appeared in the differentiation group．B：The cell cytoplasm retracted，stretched process．

Fig．3The Nestin positive cells showed in the differentiation group．A：Cell nuclei were counterstained blue by Hoechst33342．B：Nestin positive cells were green．

Fig．4The PCR amplification cure of Nestin and Hb9．A：PCR amplification of Nestin（1：a Nestin；2：b Nestin；3：c Nestin；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）．B：PCR amplification of Hb9（1：a Hb9；2：b Hb9；3：c Hb9；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）．（a：induction and differentiation group；b：natural differenti－ation group；c：control group）

Fig．5The relative quantitative results of gene Nestin and Hb9．A：The relative quantitative results of gene Nestin（a：induction and differentiation group；b：natural differentiation group；c：control group）．B：The relative quantitative results of gene Hb9（a：induction and differentiation group；b：natural differentiation group；c：control group）．

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