王喜艷 姚 健 徐邦生

（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系；江蘇226001）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白－6（BMP－6）和生長分化因子－9（GDF－9）都屬于轉(zhuǎn)換生長因子β（TGF－β）超家族的成員，在各個系統(tǒng)中均有分布。BMP－6和GDF－9在卵巢中的分布存在種屬差異性。研究發(fā)現(xiàn)BMP－6存在于人、牛、羊、豬、大鼠卵巢的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中［1－5］，小鼠的研究較少。羊、牛、小鼠中 GDF－9的表達(dá)局限于卵母細(xì)胞，在原始卵泡和（或）初級卵泡已有表達(dá)，并維持于整個卵泡發(fā)育過程。而排卵期前后的恒河猴［6］和成年兔［7］的卵母細(xì)胞、卵丘及腔壁顆粒細(xì)胞均有GDF－9蛋白的表達(dá)。

腔前卵泡體外培養(yǎng)技術(shù)是臨床輔助生殖的重要技術(shù)之一，用以研究卵泡生長發(fā)育和成熟的相關(guān)機(jī)制及影響因素。本實驗在腔前卵泡體外培養(yǎng)過程中，觀察到在培養(yǎng)第8天，卵泡腔開始形成，培養(yǎng)第10天加hCG促排卵后可獲得成熟卵母細(xì)胞。為了探討B(tài)MP－6和GDF－9蛋白在卵泡生長和成熟過程中的表達(dá)，本實驗通過免疫熒光和western blot技術(shù)觀察在體外培養(yǎng)的第6d（卵泡腔出現(xiàn)之前）、10d（卵泡腔出現(xiàn)之后）的卵泡中BMP－6和GDF－9的定位和定量表達(dá)情況及二者在卵泡發(fā)育中的變化。

材料和方法

1．實驗動物

選用清潔級出生后14d（c57b1／6×DBA／2）的F1雌性小鼠，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。

2．主要試劑和儀器

兔抗小鼠多克隆骨形態(tài)發(fā)生蛋白－6（BMP－6）抗體和羊抗小鼠多克隆生長分化因子－9（GDF－9）抗體，F(xiàn)ITC－羊抗兔抗體，TRITC－驢抗羊抗體，均購自Santa Cruz生物公司。小鼠來源多克隆β－action抗體，HRP－羊抗兔抗體 ，HRP－驢抗羊抗體，RIPA強(qiáng)裂解液，PMSF（苯甲基磺酰氟），均購自碧云天公司。聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）配制試劑盒，購自凱基生物公司。2x蛋白上樣緩沖液，購自APPLYGEN公司。增強(qiáng)顯影液，購自BIO－RAD公司。

Leica CM 1900冰凍切片機(jī)；Leica DM 400B半自動數(shù)字式正置熒光顯微鏡；信儀JY92－ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；IMPLEN分光光度計；BIO－RAD min－PROTEAN 電 泳 儀；BIO－RAD 半 干 轉(zhuǎn) 膜 儀；BIO－RAD Molecular Imager ChemiDOC XRS＋成像系統(tǒng)。

3．方法

3．1腔前卵泡的體外培養(yǎng)

14d（c57b1／6×DBA／2）F1雌性小鼠，頸椎脫臼法處死，迅速取其雙側(cè)卵巢于L－15工作液（含10%FBS和50U／ml青霉素及50mg／ml鏈霉素）中。在體視鏡下，分離去除卵巢周圍的組織，移入盛有新L－15的培養(yǎng)皿中。用規(guī)格為263／8的針頭輕劃開卵巢，分離出卵泡。根據(jù)Pedersen和Peter的分級標(biāo)準(zhǔn)的4或5a類卵泡的標(biāo)準(zhǔn)選取合適的腔前卵泡，即腔前卵泡包含一個圓的、被透明帶包繞的位于整個卵泡中間的卵母細(xì)胞，2－4層顆粒細(xì)胞，完整的基膜及附著在基膜上的若干卵泡膜細(xì)胞。將合適的腔前卵泡置于覆有石蠟油的α－MEM培養(yǎng)液滴（含5%FBS，1%ITS，0．1mIU／ml r－FSH，50U／ml青霉素及50mg／ml鏈霉素）中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，測量腔前卵泡的直徑，選取直徑在110－160μm的卵泡作為本研究對象繼續(xù)培養(yǎng)10天，隔天半定量換液。分別在培養(yǎng)第6d和第10d收集整個卵泡或顆粒細(xì)胞團(tuán)及卵丘復(fù)合體（COCs）。

3．2顆粒細(xì)胞團(tuán)冰凍切片的制備

取培養(yǎng)第6、10d的腔前卵泡和有腔卵泡的顆粒細(xì)胞團(tuán)各200個于4%多聚甲醛（PA）中固定10h，然后用0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗滌3次，每次5min。離心后，用5%蔗糖包埋細(xì)胞團(tuán)，置于－20℃冰凍切片機(jī)中10min，然后對細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為10μm。

3．3．免疫熒光染色

3．3．1顆粒細(xì)胞團(tuán)切片免疫熒光染色

將卵泡顆粒細(xì)胞團(tuán)切片置于4℃過夜。次日用0．01mol／L 的 PBS（pH 7．0－7．2）洗 3 次，每 次5min。加入含10%羊血清或驢血清的封閉液，37℃中封閉30min。后棄去封閉液，分別加入兔抗小鼠BMP－6抗體（1∶200）和羊抗小鼠 GDF－9抗體（1∶200），4℃孵育24h。再以0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗3次，每次10min。避光分別加入FITC－羊抗兔抗體和TRITC－驢抗羊抗體（1∶1000），37℃孵育3h。0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗3次，每次10min，最后加入甘油封片。熒光顯微鏡下觀察。同時做去一抗和二抗的陰性對照。

3．3．2卵丘復(fù)合體免疫熒光染色

取培養(yǎng)第6、10d卵母細(xì)胞于4%PA中固定10h，移入0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗3次，每次5min。然后將卵母細(xì)胞分別移入含10%羊血清和驢血清的封閉液，37℃中封閉30min，再分別移入兔抗小鼠BMP－6抗體和羊抗小鼠GDF－9抗體，4℃孵育24h。再以0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗3次，每次5min，然后移入熒光二抗中，37℃孵育3h。0．01mol／L的PBS（pH 7．0－7．2）洗3次，每次5min，最后將卵母細(xì)胞移到載玻片上，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。同樣做去一抗和二抗的陰性對照。

3．4Western blot

向收集的第0d（培養(yǎng)前的腔前卵泡）和第6、10 d的整個卵泡（各500個）加入RIPA強(qiáng)裂解液（含1%的PMSF），然后槍打數(shù)次至細(xì)胞完全裂解，最后12000r／min離心，取上清液，獲得提取的蛋白。95℃，5min使蛋白變性，分光光度計測濃度后分裝，然后加入等體積的2x蛋白上樣緩沖液。制膠，上樣，100v恒壓電泳約90min，然后15v半干轉(zhuǎn)膜1h，再用5%的脫脂奶粉封閉1h，最后分別加入兔抗小鼠BMP－6抗體（1∶100）、羊抗小鼠 GDF－9抗體（1∶100）和小鼠來源β－action抗體（1∶1000）孵育，4℃過夜。次日，分別以HRP－羊抗兔抗體、HRP－驢抗羊抗體和HRP－羊抗小鼠室溫孵育3h。最后，將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入ChemiDOC XRS＋成像系統(tǒng)，覆上增強(qiáng)顯影液400μl，用Image lab 3軟件進(jìn)行攝片。重復(fù)3次后用IMAGE J軟件對圖片進(jìn)行灰度值分析后作統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié) 果

1．BMP－6和GDF－9蛋白在體外培養(yǎng)卵泡中的定位表達(dá)

免疫熒光染色顯示，在體外培養(yǎng)第6、10d卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，BMP－6和GDF－9均有表達(dá)（圖1，圖2）。

2．BMP－6和 GDF－9蛋白的定量表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，在體外培養(yǎng)中，可以觀察到BMP－6和GDF－9蛋白表達(dá)量隨著卵泡的發(fā)育和成熟而呈現(xiàn)不同的變化。與培養(yǎng)前（14d小鼠）的腔前卵泡比較，BMP－6蛋白在培養(yǎng)第6d的腔前卵泡中表達(dá)量有所升高，但在培養(yǎng)第10d的有腔卵泡中又呈下降趨勢；而GDF－9蛋白雖然在培養(yǎng)第6d和第10d的卵泡中表達(dá)并無顯著差異，但二者的表達(dá)量均低于培養(yǎng)前（14d小鼠）的腔前卵泡。

圖3 BMP－6和GDF－9在體外卵泡中的定量表達(dá)Fig．3The quantitative expression of BMP－6and GDF－9 proteins in the follicles in vitro

將圖片用IMAGE J軟件進(jìn)行灰度值分析后，將目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值，得出目的蛋白的相對灰度值，即目的蛋白的相對表達(dá)量。統(tǒng)計學(xué)分析采用單因素方差分析，P＜0．05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，＊表示比較各實驗組之間具有統(tǒng)計學(xué)意義。

The photos are analysed and the gray values of stripes are calculated with the IMAGE J software．Then，the gray values of the referential protein are divided by the gray values of the objective protein，the relative expression index of the objective protein are get．The data is analysed by the means of one－way anova analysis．Statistical significance is determined when P＜0．05，and ﹡ mean there is statistical significance between the differences of groups．

討 論

在以往的研究中，BMP－6和 GDF－9蛋白的表達(dá)存在種屬差異性，BMP－6在小鼠表達(dá)的研究較少。

我們通過免疫熒光技術(shù)觀察到，在體外培養(yǎng)的卵泡中均發(fā)現(xiàn)有BMP－6和GDF－9蛋白的表達(dá)。同時western blot顯示，與培養(yǎng)前的腔前卵泡比較，體外培養(yǎng)第6d的腔前卵泡中BMP－6的表達(dá)顯著升高，但在培養(yǎng)第10d的有腔卵泡中又呈明顯下降趨勢，這與以前研究認(rèn)為BMP－6在卵泡的發(fā)育和成熟過程呈動態(tài)變化［1，8］是一致的；而第6d表達(dá)升高的結(jié)果也與文獻(xiàn)認(rèn)為其作為黃體抑制劑防止卵泡的過早成熟，［5，9－11］相一致，同時，第10d下降正是起著解除這種抑制從而促進(jìn)卵泡成熟的作用。GDF－9蛋白在培養(yǎng)第6d和第10d的卵泡中的表達(dá)并無明顯差異，但這2個時段的表達(dá)量均低于培養(yǎng)前的腔前卵泡，說明GDF－9蛋白表達(dá)量也隨卵泡發(fā)育而變化。

目前的研究發(fā)現(xiàn)這2種蛋白在卵泡發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮著重要作用。關(guān)于BMP－6對類固醇激素影響方面的研究較多，認(rèn)為其抑制孕酮的產(chǎn)生，防止卵泡過早成熟［5，8－10］，，但對于雌激素的影響存在種屬差異［10，12］。在Brankin等的研究中，BMP－6與豬的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞共同培養(yǎng)后，均刺激了二者的增殖［13］。但 Otsuka等卻發(fā)現(xiàn)BMP－6不影響大鼠的顆粒細(xì)胞數(shù)量［14］。而Koji等研究了Bmp－6基因敲除對于雌性小鼠生殖能力的影響［15］，發(fā)現(xiàn)Bmp－6基因敲除后平均每窩仔數(shù)、自然排卵率、體外成熟至受精后完全植入前的發(fā)育能力都顯著下降。關(guān)于GDF－9，Hayashi等研究證明，其能夠增加大鼠腔前卵泡的直徑和蛋白質(zhì)含量［16］；Vitt等研究證明，GDF－9能夠刺激大鼠顆粒細(xì)胞的有絲分裂，能增強(qiáng)體內(nèi)顆粒細(xì)胞的增殖和DNA的合成［17］；對于小鼠，Dong等的研究發(fā)現(xiàn)，Gdf－9基因敲除的小鼠能形成原始卵泡和初級卵泡，但在形成初級卵泡后，卵泡發(fā)育停滯［18］。

實驗結(jié)果為研究BMP－6和GDF－9對于卵泡的發(fā)育及生殖能力的影響提供了實驗依據(jù)。BMP－6和GDF－9是如何參與卵泡的發(fā)育過程、參與機(jī)制以及而二者相互作用的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

圖 版 說 明

圖1 BMP－6在小鼠體外培養(yǎng)第6、10d卵泡中的定位表達(dá)

圖1A 培養(yǎng)第6d卵泡的卵泡細(xì)胞（×400）

圖1B 培養(yǎng)第6d卵泡的卵母細(xì)胞及其周圍卵泡細(xì)胞（×400）

圖1C 培養(yǎng)第10d卵泡的顆粒細(xì)胞（×400）

圖1D 培養(yǎng)第10d卵泡的卵丘復(fù)合體（COC）（×400）

圖2 GDF－9在小鼠體外培養(yǎng)第6、10d卵泡中的定位表達(dá)

圖2A 培養(yǎng)第6d卵泡的卵泡細(xì)胞（×400）

圖2B 培養(yǎng)第6d卵泡的卵母細(xì)胞及其周圍卵泡細(xì)胞（×400）

圖2C 培養(yǎng)第10d卵泡的顆粒細(xì)胞（×400）

圖2D 培養(yǎng)第10d卵泡的卵丘復(fù)合體（COC）（×400）

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The location of BMP－6protein expression in follicles of the 6、10dculture in vitro

Fig．1AThe follicular cells of follicles from the 6dof culture（×400）

Fig．1BThe oocyte and surrounding follicular cells of follicle from the 6dof culture（×400）

Fig．1CThe granular cells of follicles from the 10dof culture（×400）

Fig．1DThe cumulus oocyte complex（COC）of follicles fromthe 10dof culture（×400）

Fig．2The location of GDF－9protein expression in follicles of the 6、10dculture in vitro

Fig．2AThe follicular cells of follicles from the 6dof culture（×400）

Fig．2BThe oocyte and surrounding follicular cells of follicle from the 6dof culture（×400）

Fig．2CThe granular cells of follicles from the 10dof culture（×400）

Fig．2DThe cumulus oocyte complex（COC）of follicles from the 10dof culture（×400）

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