范瑞琦 王 晟 揭克敏 熊小亮 肖影群 賀曉菊 劉卓琦 羅達亞＊

（1南昌大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，南昌330006；2杭州電子科技大學研究生院，浙江310018；3南昌大學附屬感染醫(yī)院病理科，江西330002；4江西省婦幼保健院，江西330005）

microRNA（miRNA，miR）是一類內源性非蛋白編碼的小RNA分子。作為動植物體內的重要調控分子，miRNA主要通過翻譯抑制、mRNA降解以及由其引導快速脫腺苷化作用起始的mRNA衰變等方式調節(jié)基因的表達［1］。由于miRNA較為穩(wěn)定，相對于mRNA不容易被降解等特性，使得其成為具有良好臨床應用潛能的分子標志物。

臨床疾病標本的應用，在驗證miRNA與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系及其調控機制中具有非常重要的價值。然而，常規(guī)收集的、不論是新鮮標本或福爾馬林固定石蠟包埋的臨床組織標本，都存在因組織標本的異質性和缺乏miRNA定位信息而使得研究并不容易獲得滿意的結果。為此，建立并應用具備定性、半定量以及定位信息的miRNA原位雜交（miRNA insitu hybridization，MISH）方法對臨床組織標本進行分析將為miRNA的研究帶來更多的便利。此項研究中，課題組選擇前期利用miRNA表達芯片篩選的miR－205作為研究靶點，建立并應用原位雜交的方法對乳腺組織芯片標本進行miR－205的表達分析，以驗證miR－205與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

材料和方法

1．組織芯片

人乳腺組織芯片購自西安艾麗娜生物技術有限公司（編號BR723），共71例／72點。71例病人均為女性，年齡18－83歲，中位年齡45歲。其中正常與乳腺良性病變36點，包括正常乳腺組織2點，癌旁正常乳腺組織3點，腺病9點，纖維腺瘤4點，乳腺增生病變18點；乳腺癌36點，包括導管原位癌3點，浸潤性導管癌18點，髓樣癌3點，粘液癌3點，小葉癌3點，遠處轉移癌6點。芯片上的組織均經常規(guī)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，5μm厚度切片，直徑1．5mm。

2．原位雜交

miR－205原位雜交檢測試劑盒購自丹麥Exiqon公司，原位雜交封閉液與洗滌液購自美國Roche公司?；具^程如下：組織芯片脫蠟，于37℃蛋白酶K消化15min，漂洗后梯度乙醇脫水。55℃預雜交30min后，地高辛標記的 miR－205探針（100nmol／L）恒溫雜交1h，堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體室溫孵育1h，NBT／BCIP黑暗處30℃顯色，核固紅復染。雜交過程選擇U6探針（1nmol／L）作為陽性對照，去除探針作為陰性對照。結果判定：miR－205呈藍色或藍紫色顆粒的陽性信號定位于乳腺腺上皮或癌細胞胞質和胞核中；U6呈藍色或藍紫色顆粒的陽性信號定位于乳腺導管上皮或間質細胞的胞核。根據陽性細胞著色的范圍分為：陽性細胞＜10%為0分；陽性細胞≥10%為1分；按著色細胞染色強度分為：無表達或弱表達為0分，中等強度或強表達為1分。以上兩項積分相乘，積分為0分表示陰性（－），積分為1分表示陽性（＋）。組織芯片的染色結果由兩位病理醫(yī)師獨立鏡檢和評分。

3．細胞培養(yǎng)

9株人乳腺細胞均由美國佐治亞醫(yī)科大學腫瘤研究中心石慧東副教授饋贈，包括高度惡性人乳腺癌細 胞 株 BT549、 HS578T、 MDA－MB－231 和SUM159PT；低度惡性人乳腺癌細胞株 MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3以及永生化正常乳腺上皮細胞株MCF10A。8株乳腺癌細胞均選擇含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF10A則用含5%馬血清、表皮生長因子（20ng／mL）、胰島素（10μg／mL）、霍亂毒素（100ng／mL）和皮質醇（500ng／mL）的DMEM／F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4．miRNA提取、逆轉錄與實時定量PCR

miRNA 提 取 按 照 mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Invitrogen，美國）說明書進行。按照 RT2miRNA First Strand Kit（SA Biosciences，美國）說明書，取1μg miRNA進行逆轉錄操作。按照RT2SYBR Green Master Mixes（SABiosciences，美國）的操作說明，以U6為 內 參 照，使 用 Light Cycler 480II instrument（Roche，瑞士）進行PCR擴增反應，每個樣品3個重復孔。U6、miR－205引物均購自美國SABiosciences公司。采用公式2－ΔCt（ΔCt＝ Ct（miR－205）– Ct（U6））計算 miR－205的相對表達量。

5．統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20．0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數資料率的比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析，檢驗水準α＝0．05。

結 果

1．miR－205的原位雜交分析

乳腺組織原位雜交后，陰性對照結果未見藍色顆粒；U6探針雜交結果顯示呈藍紫色顆粒的陽性信號定位于乳腺導管上皮或間質細胞的胞核；miR－205探針雜交結果顯示呈藍紫色顆粒的陽性信號定位于乳腺導管上皮或癌細胞胞質和胞核。結果見圖1、2。36例正常與良性乳腺病變中，33例（91．67%）積分為1分，為表達陽性（＋）；36例乳腺癌中，23例（63．89%）積分為1分，為表達陽性（＋）。miR－205的表達在乳腺良惡性病變中的表達有統(tǒng)計學差異（P＝0．011），結果見表1。miR－205的表達與乳腺癌TNM分期、臨床分期無關（P＞0．05）。

表1 miR－205在正常、良性乳腺病變和乳腺癌中的表達Table 1 miR－205expression in normal tissues，benign tumors and malignant breast cancer

2．miR－205在乳腺細胞株中的表達

采用 mirVanaTMmiRNA Isolation Kit試劑盒分別提取的總RNA和小分子量RNA，經1%瓊脂糖電泳顯示，總RNA泳道中大分子量的28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，5SrRNA等小分子量RNA的條帶較弱；小分子量RNA泳道中只存在5S rRNA等小分子量RNA，條帶較總RNA泳道中的小分子量RNA條帶清晰。結果見圖3。實時定量RT－PCR結果顯示，四個高度惡性乳腺癌細胞株（MDA－MB－231、HS578T、BT549 和 SUM159PT）中miR－205的表達較四個低度惡性細胞株（MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3）和永生化正常乳腺上皮細胞株 MCF10A中為低（P＜0．05）（圖4）。

圖1 乳腺組織中陰性對照、U6、miR－205探針的原位雜交（SP×100，NBT／BCIP顯色）圖2 組織芯片miR－205原位雜交（NBT／BCIP顯色）圖3 細胞總RNA（aRNA）與小分子量RNA（sRNA）的瓊脂糖凝膠電泳分析圖4 實時定量 RT－PCR檢測正常乳腺上皮 MCF10A和低度惡性（MDA－MB－468、T－47D、ZR－75－1和SKBR3）、高度惡性（MDA－MB－231、HS578T、BT549和SUM159PT）乳腺癌細胞株中 miR－205的表達Fig．1In situ hybridization analysis for negative，U6，miR－205in breast tissue（SP×100，NBT／BCIP solution）Fig．2In situ hybridization for miR－205in tissue array（NBT／BCIP solution）Fig．3Agarose gel electrophoresis analysis for total RNA （aRNA）and small molecular RNA （sRNA）Fig．4qRT－PCR detection for miR－205expression in normal breast epithelial cell MCF10A，less aggressive （MDA－MB－468，T－47D，ZR－75－1and SKBR3）and aggressive（MDA－MB－231，HS578T，BT549and SUM159PT）breast cancer cell lines

討 論

課題組前期利用miRNA表達芯片，在高度惡性、正常與低度惡性的12個乳腺細胞株中，共篩選到9個差異表達的miRNAs（P＜0．01，倍數值≥20或≤－20）。與正常、低度惡性細胞株相比，miR－205的表達在高度惡性乳腺癌細胞株中明顯下調［2］。為此，課題組選擇9個乳腺細胞株檢測miR－205的表達以驗證芯片分析結果。實時定量RT－PCR結果顯示，四個高度惡性乳腺癌細胞株中miR－205的表達較四個低度惡性細胞株和永生化正常乳腺上皮細胞株MCF10A中為低（P＜0．05），這與多數研究分析結果一致［3－5］。為進一步驗證 miR－205與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關系，選擇乳腺臨床標本進行miR－205的表達分析甚為必要。

在組織標本中常用的低通量miRNA檢測方法主要是Northern blotting和實時定量RT－PCR。作為經典的miRNA表達分析方法，Northern blotting是miRNA檢測的金標準。該方法主要通過熒光或放射性寡核苷酸探針與靶miRNA雜交以檢測目的miRNA的表達情況［6］，因其檢測中未經過PCR擴增而能準確反映組織樣品的實際miRNA含量，在miRNA研究的初期被廣泛應用。然而，盡管經過多次改良，該方法仍無法完全避免樣本需求量大、耗時長、操作繁瑣等缺點。實時定量RT－PCR法是現階段使用最為普遍的方法。以較為先進的stemloop RT－PCR為例，該方法不僅特異性高，可精確區(qū)分同一家族中序列高度同源性的miRNA，并能檢測只有一個堿基差別的不同miRNA的表達水平，而且該方法靈敏度也很高，樣品消耗量少，能檢測出低豐度靶miRNA［7］。然而，由于該方法可能因為PCR擴增后而失真miRNA表達結果以及組織標本異質性的特點，并不容易獲得滿意的結果。

因定性并半定量反映miRNA的表達，原位雜交在組織標本的miRNA研究中可以帶來更多的便利。Qi等［8］應用miRNA原位雜交的方法，針對乳腺正常導管上皮組織、異型扁平上皮組織、原位導管癌及浸潤型導管癌組織分析發(fā)現，組織惡性程度越高，miR－21的表達越高。Li等［9］通過建立熒光原位雜交方法對miR－375進行的研究發(fā)現，該方法不僅在食管癌細胞株miR－375的表達分析中與實時定量RT－PCR得出一致的結果，而且利用該方法還能有效地對食管癌組織芯片標本進行分析。為此，課題組成功建立并應用原位雜交的方法在乳腺標本上進行了miR－205的表達分析。雜交結果顯示miR－205主要表達在乳腺腺上皮的胞質與胞核，且miR－205的表達與乳腺病變良惡性相關（P＝0．011），在惡性病變中的表達低于正常與良性乳腺病變。該分析結果不僅驗證了在不同惡性程度乳腺細胞株上的miRNA芯片與實時定量RT－PCR的檢測結果，也與大多數應用其他方法在乳腺癌標本上的分析結果一致。Savad［10］與 Wu［3］課題組通過實時定量 RTPCR方法分別對17例和19例臨床標本分析發(fā)現，乳腺癌標本中miR－205的表達低于配對癌旁組織。Iorio等［11］利用 Northern blotting方法發(fā)現乳腺癌組織中miR－205表達明顯低于對應的癌旁正常組織。對組織芯片中36例乳腺癌標本的原位雜交結果分析顯示，miR－205的表達與病例年齡、乳腺癌TNM分期、臨床分期均無相關性（P＞0．05）。該結果與Liu等［12］對20例乳腺癌病人的血清miR－205表達與病例資料分析結果一致。然而，Baffa等［13］采用miRNA芯片對13例原位乳腺癌及其對應轉移淋巴結組織進行分析后發(fā)現，miR－205的表達在轉移灶中明顯下調。產生這種差異的原因，可能與miR－205表達檢測的方法、病例來源以及病例樣本偏小等諸多因素有關。

在臨床標本上驗證miRNA與其調控基因的關系是miRNA功能分析的重要環(huán)節(jié)。Laura Gramantieri等［14］在細胞水平上成功驗證 miR－122a和周期蛋白G1的調控關系后，通過Northern blotting和免疫印跡的方法對肝細胞癌臨床標本中的miR－122a和周期蛋白G1分別進行了表達分析。結果發(fā)現，兩者表達在同一標本中呈現明顯反變的關系。然而，因操作繁瑣和組織異質性等原因，選擇Northern blotting或實時定量RT－PCR在高通量臨床樣本中驗證miRNA及其靶點的調控關系較在細胞水平上的驗證更為困難。原位雜交結合連續(xù)切片免疫組化分析在組織樣本中驗證miRNA的靶點調控顯現出較其他方法更大的優(yōu)勢。Yamamichi等［15］采用原位雜交與免疫組化相結合的方法，發(fā)現miR－21在結腸癌組織中表達量高于正常結腸組織，而PDCD4的表達情況相反，兩者的表達定位存在明顯的反相關系。結合細胞水平的實驗，在臨床標本上進一步驗證了PDCD4是miR－21靶點的可能。這為miRNA原位雜交方法在臨床標本上的廣泛應用提出了更迫切的需求。

綜上所述，本實驗結果認為miR－205可能參與乳腺癌病變的發(fā)生、發(fā)展并在乳腺良性病變、癌變及其演進過程中呈明顯下調傾向；原位雜交方法的應用為闡明miRNA的作用機制提供了更為便利的條件。盡管本課題對miR－205在乳腺細胞株與乳腺疾病組織標本進行了表達分析，但組織標本的數量仍然較少，將實驗結論在更多乳腺組織標本的驗證仍然非常必要；同時，如何將細胞水平篩選的miR－205靶點應用原位雜交結合免疫組化方法驗證兩者之間的關系，也為后續(xù)工作提供了方向。

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