邱金泉，成 玉，張曉青，王 靜，張雨山

（國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192）

海水利用是解決沿海城市淡水供求矛盾的有效途徑，采用海水沖廁可以節(jié)省30%的城市生活用水，社會效益和經(jīng)濟效益非常顯著［1］。隨著海水沖廁技術的逐步推廣和應用，如何對海水沖廁后所產(chǎn)生的含鹽污水進行經(jīng)濟、有效的處理，已成為當前亟待研究的課題。

小球藻（Chlorella vulgaris）作為一種高污染環(huán)境耐受性的微藻，由于具有生長快速、氮磷吸收能力強等特點，目前已被廣泛應用于各類污水的處理［2－3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小球藻體內富含相當可觀的油脂類物質，可用來提取微藻油制備生物柴油［4］。因此，如能考慮將小球藻的污水處理能力與油脂積累特性進行有機結合，在凈化污水水質的同時，實現(xiàn)清潔燃料的低成本生產(chǎn)，將可謂是一舉多得。

作者以海水沖廁污水作為微藻培養(yǎng)液，考察了小球藻對海水沖廁污水中氮、磷和有機物的去除效果及其自身油脂積累特性，以期為海水沖廁污水的經(jīng)濟、高效、資源化處理提供可行途徑。

1 實驗

1.1 實驗用水

模擬海水沖廁污水由生活污水和海水按7∶3的比例配制而成，其中生活污水取自市政排污口，海水取自天津塘沽近岸海域，根據(jù)實驗需要添加一定濃度的葡萄糖、NH4Cl和KH2PO4，調節(jié)污水的CODCr、氨氮和總磷濃度分別為300mg·L－1、25mg·L－1和2.5 mg·L－1左右，再用1mol·L－1的NaOH溶液調pH值至7.5左右，污水的鹽度在11‰左右。使用前煮沸10min滅菌，冷卻。

1.2 藻種

小球藻（Chlorella vulgaris）藻種購自中國科學院水生生物研究所藻種庫。以標準BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期后備用。

1.3 方法

1.3.1 小球藻生長曲線的測定

取對數(shù)生長末期的小球藻液接種至培養(yǎng)液中，每隔72h取樣，用紫外可見分光光度儀測定藻液在680nm處的吸光值（OD680），以OD680表示藻細胞的生長情況。

1.3.2 小球藻對海水沖廁污水中CODCr、氨氮、總磷的去除

取對數(shù)生長末期的小球藻液，以4 000r·min－1離心5min后，棄上清，加入15mg·L－1的NaHCO3溶液離心洗滌2次后，加入適量無菌水配成藻液。接種至裝有200mL污水的500mL三角瓶中，接種藻密度約為106個·mL－1，實驗設置3個平行樣。接種藻液置于25℃、3000lux光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗比為12h∶12h，每日定時搖瓶3次。分別于開始培養(yǎng)后第3d、6d、9d、12d各取樣15mL，經(jīng)0.45μm醋酸纖維膜過濾后，測定CODCr、氨氮和總磷。

CODCr測定采用重鉻酸鉀法，氨氮測定采用鈉氏試劑比色法，總磷測定采用鉬銻抗分光光度法。

1.3.3 小球藻油脂的提取

采用改進的氯仿／甲醇法提取油脂［5］。取對數(shù)生長末期的小球藻液，離心收集藻細胞（10 000r·min－1，10min），經(jīng)冷凍干燥后充分研磨成藻粉。稱取100mg干藻粉，加入6mL氯仿－甲醇溶液（1∶2），振蕩提取30min，再加入2mL氯仿、3.6mL水，振蕩混勻后離心（6 000r·min－1，10min），取上清液。重復以上操作3次，將收集到的上清液混勻后離心（6 000r·min－1，5min），靜置5min，取下層氯仿至準確稱量的坩堝中，于60℃水浴中蒸干，然后轉移至60℃烘箱中烘至恒質量，稱量后計算油脂含量。

1.3.4 小球藻脂肪酸組成分析

室溫下將提取的小球藻油脂用氫氧化鉀－甲醇甲酯化后，取所得脂肪酸甲酯進行氣質聯(lián)用分析，以確定小球藻中脂肪酸組分及其含量。使用儀器為Bruker 436－GC與SCION SQ MS聯(lián)用系統(tǒng)。色譜柱：HP－5MS（30m×0.25mm，0.25μm），進樣量0.5μL，進樣口溫度250℃，載氣He，柱前壓265kPa，分流比10∶1，升溫程序：初始溫度170℃，保持2min，以10℃·min－1程序升溫至200℃，保持32min。

2 結果與討論

2.1 小球藻在海水沖廁污水中的生長狀況（圖1）

圖1 小球藻在不同培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.1 Growth curves of C.vulgarisin seawater toilet－flushing sewage and BG11medium

由圖1可以看出：BG11培養(yǎng)液中小球藻在前12d的OD680值一直保持上升，12d時達到1.572；而海水沖廁污水中小球藻的OD680值在第9d時達到最大，為0.797，隨后逐漸下降。與小球藻在BG11培養(yǎng)液中可以維持較高的生長水平相比，海水沖廁污水中小球藻的生長速度明顯較慢，其最大生物量僅為BG11培養(yǎng)液中最大生物量的50%左右。

2.2 小球藻對海水沖廁污水的凈化作用

小球藻對海水沖廁污水中氨氮、總磷和CODCr的去除效果見圖2。

圖2 小球藻對海水沖廁污水中氨氮、總磷和CODCr的去除效果Fig.2 Removal efficiency of NH＋4－N，TP and CODCrfrom seawater toilet－flusing sewage during C.vulgaris cultivation

由圖2可以看出：海水沖廁污水中的氨氮和總磷在培養(yǎng)初期消耗很快，第3d時氨氮濃度由初始的22.6mg·L－1降至7.56mg·L－1，去除率為66.5%，而總磷濃度由初始的2.624mg·L－1降至0.224mg·L－1，去除率達到了91.5%。此后隨培養(yǎng)時間的延長，氨氮和總磷的濃度一直保持下降趨勢，至第12d時，小球藻對海水沖廁污水中氨氮和總磷的去除率分別達到87.9%和98.2%。與氨氮和總磷的去除不同，小球藻對海水沖廁污水中CODCr的凈化作用非常有限，實驗期間CODCr濃度下降比較緩慢，至第12d實驗結束時，CODCr濃度由初始的338.7mg·L－1降至264.8mg·L－1，去除率僅為21.8%。

2.3 不同培養(yǎng)液中小球藻油脂產(chǎn)率比較

分別用BG11培養(yǎng)液和海水沖廁污水培養(yǎng)小球藻，第9d時離心收獲藻體，經(jīng)冷凍干燥后，測定兩種不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)出的小球藻的生物量及干藻粉中總脂含量，結果見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)液收獲的干藻生物量和總脂含量Fig.3 Biomass production and total lipid content in different culture media

由圖3可以看出：用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻干生物量為0.84g·L－1，細胞總脂含量為28.86%；而用海水沖廁污水培養(yǎng)的小球藻干生物量為0.47g·L－1，細胞總脂含量較高，達到33.03%。進一步計算可知用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)小球藻，每升培養(yǎng)液可收獲微藻油脂0.2419g，而用海水沖廁污水培養(yǎng)小球藻，每升培養(yǎng)液可收獲微藻油脂0.1533g，是BG11收獲量的64.2%。

2.4 不同培養(yǎng)液中小球藻脂肪酸組成分析（表1）

表1 不同培養(yǎng)液中小球藻脂肪酸組成／%Tab.1 The fatty acid compositions of C.vulgarisin different culture media／%

大多數(shù)產(chǎn)油微藻的脂肪酸組成與油料植物相似，小球藻也不例外。由表1可以看出，BG11培養(yǎng)液與海水沖廁污水培養(yǎng)的小球藻脂肪酸主要組分有C16：0的軟脂酸、C16：1的棕櫚一烯酸、C18：2的亞油酸以及C18：3的亞麻酸等。與BG11中培養(yǎng)的小球藻相比，海水沖廁污水中培養(yǎng)的小球藻的脂肪酸中亞油酸比例有所上升，此外還檢出了少量C14：0豆蔻酸、C17：0十七烷酸、C18：0硬脂酸、C18：1油酸等組分。總體來看，海水沖廁污水培養(yǎng)的小球藻的脂肪酸以C16和C18為主，符合作為生物柴油生產(chǎn)原料的要求。

2.5 討論

2.5.1 海水沖廁污水中小球藻的生長及其對污染物的凈化

氮、磷作為維持藻類正常生長的必需元素，在小球藻的生長、繁殖等生理過程中起著非常重要的作用。海水沖廁污水中氮、磷的濃度相比BG11培養(yǎng)液要低很多，養(yǎng)分的缺乏使得小球藻的生長速度及生物量都較低，特別是在生長的中后期（6d后），這種差距更為明顯，同時培養(yǎng)液中的磷含量已經(jīng)降到了很低的水平（圖2b），限制了小球藻的增殖。除氮和磷之外，鹽度也是影響小球藻正常增殖的重要因子，雖然小球藻對鹽度有較強的適應性，但海水沖廁污水的鹽度較高，仍可能會對小球藻的生長產(chǎn)生抑制作用。

小球藻對海水沖廁污水中氨氮和總磷具有較強的吸收凈化能力，去除率分別達到87.9%和98.2%，特別是在培養(yǎng)初期，小球藻細胞能夠從培養(yǎng)液中快速攝取氮磷等營養(yǎng)元素供其快速生長。藻類對有機污染物的代謝過程就是利用有機物作為碳源、能源生長的過程，與氮磷的凈化去除不同，實驗過程中小球藻除可以利用海水沖廁污水中的有機物外，還可以吸收空氣中的CO2作為碳源進行生長和代謝，這可能是小球藻對海水沖廁污水中CODCr凈化效率偏低的主要原因。

2.5.2 海水沖廁污水中小球藻的產(chǎn)油特性

脂肪酸甲酯是生物柴油的主要存在形式，因此，通過測定小球藻的脂肪酸總量及組分，可以評估小球藻用于生產(chǎn)生物柴油的潛力。實驗發(fā)現(xiàn)小球藻能夠較好地適應海水沖廁污水環(huán)境，并且收獲的藻體內的總脂含量甚至還要高于BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻。雖然單位體積培養(yǎng)液獲得的油脂質量與采用BG11培養(yǎng)液相比有所降低，但是由于海水沖廁污水作為培養(yǎng)基廉價易得，并且在獲得清潔能源的同時可以解決環(huán)境污染問題，如能通過技術優(yōu)化，提高微藻生長與產(chǎn)油速率，將具有良好的應用前景。

目前關于培養(yǎng)條件對微藻脂肪酸組成及產(chǎn)量影響的研究較多，學者普遍認為，營養(yǎng)鹽特別是氮的短缺或受限能夠加快微藻細胞內油脂的積累，并可能改變微藻的脂肪酸組成［6－7］。除此之外，其它因素如鹽度、光照等因素的改變也會使小球藻中脂肪酸的飽和度發(fā)生變化［8－9］。與BG11中小球藻油脂的累積相比，海水沖廁污水培養(yǎng)的小球藻的總脂含量和脂肪酸的種類均有所增加，可認為是鹽度、氮脅迫等多種因素共同作用的結果。

3 結論

（1）與BG11培養(yǎng)液相比，小球藻在以海水沖廁污水作為培養(yǎng)液時，其生長速率和生物量均明顯較低。

（2）小球藻能夠有效吸收海水沖廁污水中的氮、磷，培養(yǎng)12d時，對氨氮和總磷的去除率分別達到87.9%和98.2%，對CODCr的去除率為21.8%。

（3）采用海水沖廁污水培養(yǎng)出的小球藻細胞總脂含量較高，達到33.03%。海水沖廁污水中小球藻脂肪酸組成與采用BG11培養(yǎng)液培養(yǎng)的小球藻相比略有變化，但總體仍以C16和C18為主，符合作為生物柴油生產(chǎn)原料的要求。

總之，利用海水沖廁污水培養(yǎng)小球藻，可以在處理污水的同時產(chǎn)生微藻油脂，具有良好的發(fā)展前景和應用潛力。

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