姚 旭，鄭自通，郭 玉，余柳英，魏 云，鄭 興

(1.南華大學(xué)藥學(xué)系，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科)

染料木黃酮(genistein，GEN)，主要存在于豆科植物中，是一種具有多種生物活性的大豆異黃酮，具有弱雌激素活性[1-2]、抗氧化活性和抗真菌活性[3-4]，對(duì)肝癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肺癌[7]、胃癌[8]和前列腺癌[9]等多種疾病有積極的預(yù)防和治療作用。但因染料木黃酮在腸道內(nèi)吸收甚少或者完全不吸收致使其活性較低而限制了它的臨床應(yīng)用[10]。為了提高染料木黃酮的生物利用度，達(dá)到增強(qiáng)其抗癌活性的目的，本文以體外培養(yǎng)的人急性粒細(xì)胞性白血病(HL-60)細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HT-29)和人胃癌(SGC-7901)細(xì)胞為研究對(duì)象，以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)為陽(yáng)性對(duì)照，選用MTT法對(duì)合成的4個(gè)烷氧染料木黃酮衍生物進(jìn)行體外抗癌活性篩選。

1 材料與方法

1.1 主要材料

所用試劑均為分析純，柱層析用硅膠G購(gòu)自青島海洋化工廠，HL-60細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、HT-29細(xì)胞均由中南大學(xué)腫瘤研究所提供。X-5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，溫度未校正；Bruker AM-300(300 MHz)型核磁共振儀，TMS作內(nèi)標(biāo)；Shimadzu IR-440型紅外分光光度儀，溴化鉀壓片；HP-5989A型質(zhì)譜儀；Italian Carlo-Erba 1106型元素分析儀；Bruker Apex Ⅱ質(zhì)譜儀。

1.2 烷氧染料木黃酮衍生物的制備

染料木黃酮(100 mg，0.3 mmol)，用適量丙酮溶解，加入鹵代烴RX(3 mmol)，K2CO3作催化劑，回流24 h，過(guò)濾，柱層析得到化合物2a、2b和3a、3b(見圖1)。

圖1 化合物2a、2b、3a、3b合成路線圖

1.3 MTT法檢測(cè)所合成染料木黃酮衍生物的抗癌活性

HL-60、HT-29、SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10％熱滅活小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，5％二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，以含細(xì)胞的加料RPMI-1640培養(yǎng)基接種于實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組(5-Fu濃度為0.25 μmol/L)，溶媒對(duì)照組及調(diào)零組，每組設(shè)6個(gè)平行樣本，每孔100 μL單細(xì)胞懸液(約2×104個(gè)細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)組每孔加入以培養(yǎng)基稀釋的藥物100 μL，溶媒對(duì)照組加入等量的含0.02％DMSO和0.01％ Tween-80的培養(yǎng)液，調(diào)零組加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，1 000 r/min離心10 min后吸除上清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，震蕩10 min，使紫藍(lán)色沉淀充分溶解，在(EX-800型)酶標(biāo)儀下，用調(diào)零孔校正零點(diǎn)，以570 nm波長(zhǎng)測(cè)定A值。以6孔A值均數(shù)計(jì)算相對(duì)抑制率(IR)：IR=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100％，重復(fù)3批實(shí)驗(yàn)。半數(shù)抑制濃度(50％ concentration of inhibition，IC50)采用SPSS軟件計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 化合物的合成

本實(shí)驗(yàn)合成了4個(gè)染料木黃酮衍生物2a、2b、3a、3b。

化合物2a Yield 83.5％；m.p.138～139 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：298(M+，100.00)，271(34.39)，132(21.39)，299(19.86)，166(19.24)，283(12.00)，138(11.48)，89(10.61)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：3.381(3H，s，OCH3)，3.900(3H，s，OCH3)，6.407(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.422(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，7.003(2H，d，J=9.9Hz，H-3′and H-5′)，7.484(2H，d，J=9.9Hz，H-2′and H-6′)，7.893(1H，s，H-2)，12.890(1H，s，OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致，可以確定該化合物為5-羥基-4′,7-二甲氧基染料黃酮。

化合物2b Yield 77.5％；m.p.117～119.5 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：349(M+，100.00)，308(37.62)，350(M+，23.86)，275(17.25)，291(16.94)，41(14.77)，293(14.48)；IR υmax(cm-1，KBr)：1649(C=O)，2954(OH)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.556～5.087(4H，m，2×CH2O)，5.283～5.485(4H，m，2×CH2)，5.928～6.114(2H，m，2×CH)，6.372(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，6.982(1H，d，J=2.1Hz，H-6)，7.428(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，7.833(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.862(1H，s，H-2)，12.981(1H，s，OH)；13C NMR(CDCl3)：180.824(C=O，C-4)，164.461(C-7)，162.722(C-5)，158.816(C-4′)，157.877(C-9)，152.675(C-2)，133.077(allyl-4′，CH)，132.047(allyl-7，CH)，130.056(2C，C-2′and C-6′)，123.633(C-3)，123.076(C-1′)，118.507(allyl-4′，CH2)，117.797(allyl-7，CH2)，114.906(2C，C-3′and C-5′)，114.654(C-10)，98.772(C-6)，93.134(C-8)，69.120(allyl-4′，OCH2)，68.868(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.for C21H18O5：C，71.99，H，5.18；Found：C，71.86，H，5.16。

化合物3a Yield 10.1％；m.p.161～163 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：312(M+，100.00)，313(75.82)，266(29.62)，267(25.53)，132(22.94)，283(20.88)，281(19.92)，282(17.92)；1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)：3.759(3H，s，OCH3)，3.806(3H，s，OCH3)，3.857(3H，s，OCH3)，6.484(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，6.635(1H，d，J=2.4Hz，H-8)，6.940(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.416(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，8.167(1H，s，H-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的基本一致，可以確定該化合物為4′,5,7-三甲氧基染料黃酮。

化合物3b Yield 11.6％；m.p.101～104 ℃；MS(EI，70 eV)m/z(％)：390(M+，100.00)，361(95.87)，293(88.82)，41(45.92)，321(44.10)，349(37.56)，252(37.22)，362(34.97)；IR υmax(cm-1，KBr)：1644(C=O)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：4.546～4.637(6H，m，3×CH2O)，5.262～5.688(6H，m，3×CH2)，6.002～6.110(3H，m，3×CH)，6.383(2H，d，J=2.1Hz，H-6)，6.425(1H，d，J=2.1Hz，H-8)，6.939(2H，d，J=8.7Hz，H-3′and H-5′)，7.440(2H，d，J=8.7Hz，H-2′and H-6′)，7.719(1H，s，H-2)；13C NMR(CDCl3)：175.179(C=O，C-4)，162.546(C-7)，160.303(C-5)，159.762(C-4′)，158.419(C-9)，149.970(C-2)，133.237(allyl-5，CH)，132.108(2C，allyl-7，allyl-4′，CH)，130.361(2C，C-2′and C-6′)，126.028(C-3)，124.548(C-1′)，118.545(allyl-5，CH2)，118.003(allyl-4′，CH2)，117.614(allyl-7，CH2)，114.555(2C，C-3′and C-5′)，110.268(C-10)，97.803(C-6)，93.592(C-8)，69.837(allyl-5，OCH2)，69.158(allyl-4′，OCH2)，68.799(allyl-7，OCH2)；Anal.Calcd.For C24H22O5：C，73.83，H，5.68；Found：C，73.87，H，5.72。

2.2 染料木黃酮衍生物體外抗癌活性

以5-Fu為陽(yáng)性對(duì)照，MTT法檢測(cè)原料藥染料木黃酮1與合成的4個(gè)烷氧染料木黃酮衍生物2a、2b、3a、3b對(duì)HL-60、HT-29、SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果見表1。其中化合物3a對(duì)HL-60、HT-29和 SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用均強(qiáng)于5-Fu。

表1 黃酮類化合物對(duì)HT-29、SGC-7901和HL-60細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

本文將部分烷氧基團(tuán)引入到染料木黃酮的結(jié)構(gòu)中，并通過(guò)MTT法檢測(cè)它們對(duì)HL-60、HT-29、SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用。初步藥理活性研究表明：所合成的染料木黃酮衍生物對(duì)HL-60、HT-29、SGC-7901細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中衍生物3b對(duì)HL-60的抑制作用最強(qiáng)，衍生物3a對(duì)HL-60、HT-29、SGC-7901抑制增殖作用均明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-Fu，這為進(jìn)一步獲得高效、低毒的抗癌先導(dǎo)物提供有利的依據(jù)。

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