齊 琦 武世伍 承澤農(nóng) 郭 飛

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室233030；2蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科233000；3蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院影像科233000）

KAI1／CD82基因是1995年發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因［1］，屬于4次跨膜超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成員，它通過(guò)改變細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力及細(xì)胞間相互作用，抑制腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，從而起到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［2，3］，廣泛表達(dá)于多種組織。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白－1（Gli1）是Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，對(duì)腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移起重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)96例GAC組織標(biāo)本中KAI1／CD82和Gli1蛋白的表達(dá)，旨在探討其表達(dá)與胃腺癌（gastric adenocarcinoma，GAC）的臨床病理特征的關(guān)系，希望能夠找到早期預(yù)測(cè)GAC患者浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

材料和方法

1.材料與方法

1.1 一般資料 收集2007年1月～2009年7月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔GAC組織石蠟包埋標(biāo)本96例（患者術(shù)前均未行放、化療和其它抗腫瘤治療）和癌旁胃組織20例，所有病例均有完整的臨床和病理資料。其中男性69例，女性27例；年齡28～83歲，中位年齡61.3歲，選取的胃癌組織包括高分化腺癌18例，中分化腺癌45例和低分化腺癌33例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例50例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例46例。根據(jù)2002國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期60例，Ⅲ期30例，Ⅳ期2例。對(duì)照組20例選取距離腫瘤組織＞5cm，且經(jīng)病理HE染色證實(shí)為正常胃黏膜組織。

1.2 試劑 鼠抗人KAI1／CD82單克隆抗體，兔抗人Gli1多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz，ElivisionTMplus試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組化ElivisionTMplus法將石蠟標(biāo)本經(jīng)4？倕m厚連續(xù)切片，烤干，脫蠟，水洗。免疫組化步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用已知陽(yáng)性片作對(duì)照，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定KAI1／CD82蛋白主要分布在細(xì)胞膜和漿中，Gli1蛋白主要分布在細(xì)胞核和漿中，均以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。染色結(jié)果的評(píng)分，按每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分率及著色深淺。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率判定：每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野（×400），分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分，＜10%為0分；10%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。根據(jù)染色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色1分，黃色為2分，棕褐色3分。兩項(xiàng)得分相乘，并取10個(gè)高倍視野的平均值為最終評(píng)分：陰性（0～1）、弱陽(yáng)性（2～4）、陽(yáng)性（5～8）、強(qiáng)陽(yáng)性（＞9），大于2分視為陽(yáng)性結(jié)果［4］。2位病理醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲法來(lái)判定免疫組織化學(xué)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用χ2和Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

2.1 KAI1／CD82蛋白在GAC組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系 KAI1／CD82蛋白陽(yáng)性顆粒呈棕黃（褐）色，在正常胃黏膜組織中，主要位于胞膜和胞漿（圖1：A）；在GAC組織中，主要表達(dá)于GAC細(xì)胞膜，胞漿中也有一定的表達(dá)（圖1：B，C，D）。KAI1／CD82蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤的位置和大小無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。在GAC病例組中，KAI1／CD82蛋白的陽(yáng)性率為38.5%（37／96），比正常對(duì)照胃組織的表達(dá)率90%（18／20）明顯減少（P＜0.01）（表1）。Ⅰ～Ⅱ期病例組 KAI1／CD82雖然高表達(dá)，但較正常對(duì)照組表達(dá)水平下降，陽(yáng)性表達(dá)率51.6%，Ⅲ～Ⅳ期病例組KAI1／CD82表達(dá)水平進(jìn)一步下調(diào)，其陽(yáng)性表達(dá)率為12.5%，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；在GAC高分化組、中等分化組以及低分化組中KAI1／CD82的陽(yáng)性表達(dá)率分別為88.9%，35.6%和15.2%，呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；GAC中浸潤(rùn)至漿膜較浸潤(rùn)至肌層及以上KAI1／CD82的陽(yáng)性表達(dá)明顯減低（P＜0.01）；KAI1／CD82蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移也有關(guān)（P＜0.005）（表2）。

2.2 Gli1在GAC組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系 Gli1蛋白陽(yáng)性顆粒主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，呈黃色或棕黃色。本對(duì)照組未見(jiàn)Gli1蛋白表達(dá)（圖1：E），在GAC組織中Gli1蛋白的陽(yáng)性率為68.8%（66／96）（圖1：F，G，H）。Gli1蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫瘤的位置和大小無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），但隨著分化越差、浸潤(rùn)越深、臨床分期越晚及淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高（表2）。

2.3 KAI1／CD82及Gli1在GAC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman等級(jí)相關(guān)性分析顯示，KAI1／CD82和Gli1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) （rs＝0.343，P＜0.005）。

表1 KAI1／CD8和GLI1在GAC組織和正常胃組織中的表達(dá)Table 1 Expression of KAI1／CD82 and Gli1 in GAC tissues and normal gastric tissues

圖1 KAI1／CD82和Gli1在GAC中的陽(yáng)性染色以及對(duì)照組中的染色。A：對(duì)照組中KAI1／CD82表達(dá)陽(yáng)性（Elivision TM×100）；B、C、D：胃腺癌組織中 KAI1／CD82表達(dá)（B為高分化腺癌，C為中分化腺癌，D為低分化腺癌；Elivision TM×400）；E：對(duì)照組中Gli1表達(dá)陰性（Elivision TM×100）；F、G、H：胃腺癌組織中Gli1表達(dá)（F為高分化腺癌，G為中分化腺癌，H為低分化腺癌；Elivision TM×400）Fig1：Positive staining of KAI1／CD82 and Gli1 in GAC tissues and staining in the control group.A：Positive staining of KAI1／CD82 in the control group（A is normal gastric tissues，Elivision TM×100）；B、C、D：Positive staining of KAI1／CD82 in GAC tissues（B is well differentiation andenocarcinoma，C is mediate differentiation andenocarcinoma，D is poor differentiation andenocarcinoma，Elivision TM×400）；E：Negative staining of Gli1 in the control group（E is normal gastric tissues，Elivision TM×100）；F、G、H：Positive staining of Gli1 in GAC tissues（F is well differentiation andenocarcinoma，G is mediate differentiation andenocarcinoma，H is poor differentiation andenocarcinoma，Elivision TM×400）

表2 GAC組織中KAI1／CD8和GLI1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系Table 2 Correlation of KAI1／CD8 and GLI1 expression to clinicopathologic characteristics in gastric andenocarcinoma tissues

表3 GAC組織中KAI1／CD8和GLI1的關(guān)系Table 3 Relationship of KAI1／CD8 and GLI1 expression in gastric andenocarcinoma tissues

討 論

腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，有多種基因參與，其中許多腫瘤抑制基因也參與了調(diào)控。GAC的發(fā)生、發(fā)展，也是眾多因子相互協(xié)調(diào)并共同作用的結(jié)果。隨著組織芯片技術(shù)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的腫瘤相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，他們可能促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)或抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，因此，尋找能夠預(yù)測(cè)GAC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)GAC的早期正確診斷、治療以及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

KAI1／CD82是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它是Dong等［5］在研究前列腺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)的，最初被認(rèn)為是前列腺癌特異性的轉(zhuǎn)移抑制基因。后來(lái)相繼發(fā)現(xiàn)并報(bào)道在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中出現(xiàn)KAI1／CD82表達(dá)水平的下調(diào)或缺失。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)KAI1／CD82蛋白在GAC組織及正常胃組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KAI1／CD82蛋白在正常胃黏膜組織中高表達(dá)，在Ⅰ～Ⅱ期GAC組織中其表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，并且隨著腫瘤的分化越差、臨床分期越高、浸潤(rùn)加深，其陽(yáng)性表達(dá)率也越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GAC組織中其陽(yáng)性表達(dá)率也明顯降低，這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者［6－8］研究的結(jié)果相一致。這均提示KAI1／CD82基因缺失或表達(dá)異常降低與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤組織中KAI1／CD82基因表達(dá)缺失或下調(diào)使KAI1／CD82基因的正常功能減弱或消失，失去了抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的功能。

Gli1是Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，有研究表明人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移與 Hh信號(hào)通路異常激活密切相關(guān)［9－11］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號(hào)通路與腫瘤的血管形成有關(guān)，而血管的生成為促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了必需的途徑。本研究結(jié)果顯示，Gli1蛋白在GAC組織中的表達(dá)水平比在正常組織中明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腫瘤分化越差、臨床分期越晚、浸潤(rùn)越深，其表達(dá)水平也越高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且在伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中其表達(dá)較未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與文獻(xiàn)報(bào)道［12，13］一致。本研究結(jié)果提示Gli1在腫瘤組織中呈現(xiàn)的高表達(dá)狀態(tài)，在GAC的發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起到重要作用。

Spearman相關(guān)分析顯示在GAC組織中，KAI1／CD82蛋白的表達(dá)與Gli1蛋白的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)性。當(dāng)腫瘤組織生長(zhǎng)到1mm3時(shí)，就會(huì)誘導(dǎo)新生血管形成，否則就會(huì)停止生長(zhǎng)，而Gli1基因表達(dá)增高時(shí)會(huì)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的新生血管形成能力，這些新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞不完整或有缺陷；而此時(shí)KAI1／CD82基因表達(dá)降低或缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞彼此之間的黏附力降低，在血流的沖擊下，很容易離開(kāi)原發(fā)腫瘤并穿過(guò)不完整的內(nèi)皮細(xì)胞，最終導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［14］。

綜上所述，通過(guò)在GAC組織中檢測(cè)KAI1／CD82和Gli1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Gli1蛋白高表達(dá)和KAI1／CD82蛋白表達(dá)降低或缺失時(shí)，GAC的腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移。因此，可以通過(guò)早期聯(lián)合檢測(cè)KAI1／CD82和Gli1蛋白的表達(dá)，作為評(píng)估GAC患者腫瘤侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

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