楊世明 張敏海 張亦農(nóng) 汪薇曦 王小麗

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系組織胚胎學(xué)教研室，武漢430030）

單層扁平上皮在機(jī)體內(nèi)分布非常廣泛，具有重要的生理功能。制作高質(zhì)量的單層扁平上皮教學(xué)標(biāo)本，可使學(xué)生在顯微鏡下清晰觀察并掌握其基本的形態(tài)結(jié)構(gòu)，幫助學(xué)生進(jìn)一步鞏固理論知識，加深理解機(jī)體組織結(jié)構(gòu)與生理功能之間的關(guān)系，對于滿足實驗教學(xué)要求、保證教學(xué)效果等具有重要意義。本實驗從動物種屬、照射方式、硝酸銀濃度、浸染時間等方面對單層扁平上皮鋪片制作方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實驗研究。

材料和方法

1.實驗動物和主要試劑

健康成年的 Wister大鼠，家兔，狗均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。硝酸銀購自美國Sigma公司。0.5－1%硝酸銀溶液：0.5－1g加100 ml雙蒸水，充分溶解后備用。

2.實驗方法

將大鼠和家兔麻醉后取腸系膜，將每種動物的材料分為兩部分。一部分放入盛有0.5－1%硝酸銀溶液的培養(yǎng)皿中，置于日光下照射；另一部分放入盛有0.5－1%硝酸銀溶液的培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下照射。時間15－60 min不等，以組織呈棕褐色為度。照射結(jié)束后，所有標(biāo)本用蒸餾水洗。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分色數(shù)秒后再水洗。從腸系膜上取單層扁平上皮進(jìn)行鋪片，晾干后用中性樹膠封片。狗的大網(wǎng)膜處理方法同上，但只進(jìn)行日光照射。

結(jié) 果

將制作的單層扁平上皮鋪片標(biāo)本置于顯微鏡下，選擇鋪成單層且背景較清楚的部位觀察。日光照射組中，大鼠、家兔、狗鋪片標(biāo)本的上皮細(xì)胞均呈不規(guī)則形或多邊形，相鄰細(xì)胞之間有較大且多的棕褐色硝酸銀顆粒沉積，著色較深。胞質(zhì)內(nèi)的硝酸銀顆粒細(xì)小而分散。細(xì)胞核呈橢圓形，著藍(lán)色（圖1－3）。紫外燈照射的標(biāo)本中，大鼠、家兔腸系膜上皮組織較松散，細(xì)胞形態(tài)欠完整。

圖1 大鼠腸系膜鋪片，硝酸銀染色×400圖2 家兔腸系膜鋪片，硝酸銀染色×400圖3 狗大網(wǎng)膜鋪片，硝酸銀染色×400Fig.1 Spread preparation of mesenteric，rat，silver nitrate staining×400Fig.2 Spread preparation of mesenteric，rabbit，silver nitrate staining×400Fig.3 Spread preparation of omentum，dog，silver nitrate staining×400

討 論

單層扁平上皮鋪片標(biāo)本的鏡下觀察是組織學(xué)實驗教學(xué)的重要內(nèi)容，但制片過程費時且不易獲得薄而平整、著色均勻、結(jié)構(gòu)清晰的標(biāo)本。制片受許多因素影響，如實驗動物的品種選擇、季節(jié)的不同、日光或紫外燈照射的強度、硝酸銀溶液的濃度、浸染時間的控制以及取材部位的選擇、鋪片技術(shù)、標(biāo)本的處理和染色均直接影響制片效果。存在的較為普遍的問題是標(biāo)本背景欠清晰、銀沉淀較多、細(xì)胞核模糊或不顯色等。為制作符合教學(xué)要求的鋪片標(biāo)本，我們從實驗方法和實驗條件等方面進(jìn)行了摸索。

據(jù)報道，郭青平等［1］取狗的大網(wǎng)膜作為實驗材料，入1%硝酸銀溶液中，利用日光或陽光照射的方法制片。任知春等［2］取兔、狗的大網(wǎng)膜或腸系膜，浸于1.5%硝酸銀溶液30－60 min，經(jīng)蒸餾水洗，置強日光或紫外線燈照射至棕色。水洗后入2.5%硫代硫酸鈉固定。再復(fù)染細(xì)胞核、分色、水洗、石碳酸－木榴油－二甲苯脫水透明、二甲苯透明、樹膠封片。王建新等［3］取家兔大網(wǎng)膜，入0.2%硝酸銀溶液中浸染，選擇了紫外線燈照射的方法。柳潔等［4］則采取了注射的方式，即將0.5%硝酸銀溶液緩慢注入小白鼠腹腔，30min后取大網(wǎng)膜鋪片。這些實驗均獲得了一定的結(jié)果。

為節(jié)省制片成本，我們選擇大鼠和家兔等小動物進(jìn)行預(yù)實驗。鋪片時體會到日光照射的標(biāo)本較紫外燈照射的標(biāo)本組織的彈性和韌性要好，且浸染過程中觀察和操作非常方便，時間易控制。而紫外燈照射的大鼠、家兔腸系膜上皮組織相對較松散，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不夠完整，且照射時間不易掌握，操作不便。故在使用材料相對多的狗的大網(wǎng)膜做實驗時，直接采用日光照射而未用紫外燈照射，以獲得更多有用的鋪片標(biāo)本。

我們分別使用了大鼠、家兔、狗等實驗動物。取材后直接進(jìn)行浸染和光照還原，在實驗中簡化了操作。未采用硫代硫酸鈉還原，且省去了石碳酸－木榴油－二甲苯脫水透明及二甲苯透明的步驟。石碳酸具有強毒性和強腐蝕性［5］。我們將鋪片晾干后直接用中性樹膠封片。避免接觸這些揮發(fā)性大、對人體健康有害的有毒試劑。結(jié)果不同動物的單層扁平上皮細(xì)胞鋸齒狀邊界呈棕褐色線條，細(xì)胞核淡藍(lán)色，結(jié)構(gòu)較為清晰。在使用不同濃度的硝酸銀溶液進(jìn)行比較時，觀察到選擇0.5%和1%的濃度，浸染效果差別不大。而浸染與光照還原要適度，浸染時間隨季節(jié)和日光的強弱不同需靈活掌握，以組織呈棕褐色為度。顏色過淺，則細(xì)胞邊界不清。反之，背景太深而影響觀察。從制片結(jié)果來看，大鼠的單層扁平上皮鋪片標(biāo)本中細(xì)胞核的收縮較家兔明顯，而狗的鋪片標(biāo)本的結(jié)構(gòu)保存相對較好，這種差別的產(chǎn)生是否與動物種屬等因素有關(guān)尚有待于進(jìn)一步研究。

近年來，我們在組織學(xué)實驗教學(xué)方法和手段上進(jìn)行了一些改革創(chuàng)新。應(yīng)用Motic數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)，將傳統(tǒng)的玻璃組織切片轉(zhuǎn)換為數(shù)字切片，提高了形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)效果［6］。但數(shù)字切片不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)玻璃切片的全部功能，制作適合于教學(xué)要求的單層扁平上皮鋪片標(biāo)本是非常必要的。鑒于狗的大網(wǎng)膜可獲得較多的鋪片材料，因此更適合于教學(xué)標(biāo)本的批量制作。

［1］郭青平，李莉.單層扁平上皮銀法中顯示方式的改良.實用醫(yī)技雜志，2008，15（10）：1265－1266

［2］胡登焜，楊森，劉志勛等.組織學(xué)特殊染色技術(shù)實踐.西安：陜西師范大學(xué)出版社，1989，46－47

［3］王建新，王瑋.單層扁平上皮標(biāo)本制作技術(shù)的改進(jìn).福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，36（4）：465

［4］柳潔，馬曉健.間皮細(xì)胞鍍銀染色法的改進(jìn).解剖學(xué)雜志，2005，28（6）：628

［5］汪薇曦，楊世明，葉翠芳等.一種應(yīng)用振蕩切片顯示神經(jīng)元的Cox染色法.解剖學(xué)報，2008，39（5）：779－781

［6］葉翠芳，李和，楊世明.數(shù)字切片在形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)中的應(yīng)用.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育版），2008，10（4）：497－499