[摘要]目的：探討苦參堿（Matrine，簡(jiǎn)稱Mat）的藥理活性，研究苦參堿對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用，為皮膚損傷后出現(xiàn)的增生性瘢痕的治療提供理論支持及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將不同濃度梯度Mat作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，測(cè)MTT反應(yīng)的A0值及LDH值，利用通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期、DNA相對(duì)含量，用免疫組織化學(xué)檢測(cè)Mat用藥前后的細(xì)胞核內(nèi)增殖性抗原（proliferatingcell nuclear antigen，PCNA）的表達(dá)。結(jié)果：增生性瘢痕成纖維細(xì)胞在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性增殖抑制，但LDH值無(wú)明顯改變；DNA相對(duì)含量無(wú)明顯變化，PCNA表達(dá)逐漸減弱。結(jié)論：Mat 在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖而不引起細(xì)胞壞死性改變，但對(duì)DNA含量無(wú)明顯影響。

[關(guān)鍵詞]苦參堿；增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）12-1291-03

組織損傷修復(fù)是人體自我保護(hù)的一個(gè)正常病理過程，而過度修復(fù)則會(huì)出現(xiàn)組織纖維化，造成增生性瘢痕的出現(xiàn)，從而影響組織、器官的正常功能，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)異常病變，這種疾病導(dǎo)致的結(jié)果是使機(jī)體的外形改變以及造成某些功能的喪失和障礙。目前醫(yī)學(xué)工作者將創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成的機(jī)制及其治療作為外科研究的重點(diǎn)，花費(fèi)了大量精力在臨床研究上，因此，在這一方面取得了不小的成果[1]?？鄥㈩惿飰A是以苦參堿為代表，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的一類生物堿物質(zhì)[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在研究、使用苦參類生物堿的過程中發(fā)現(xiàn)其多方面的藥理活性及生物學(xué)功能。在目前的研究中，苦參類生物堿是我們多年來(lái)使用的增生性瘢痕軟化膏的主要活性成分，其臨床效果明顯，能明顯抑制瘢痕的增生，使增生性瘢痕縮小且軟化。所以說，苦參類生物堿對(duì)于皮膚的損傷修復(fù)具有一定的療效，尤其對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的抑制作用非常明顯，對(duì)于它的作用機(jī)制，需要做進(jìn)一步研究，從而更好的研發(fā)出作用療效較高的治療藥物。為此，我們深入探討其作用機(jī)制，本次試驗(yàn)的對(duì)象為體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞，通過觀察及收據(jù)分析，深入研究苦參堿對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期及DNA含量的影響，從而得出結(jié)論。

1 材料和方法

1.1 一般材料：①試驗(yàn)所用藥品苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品、生物制品檢定所購(gòu)買所得，性狀為為水溶性粉劑，溶于三蒸水中，濃度為50mg/ml，并且生物堿溶液要經(jīng)過過濾除菌，最后制成備用溶液儲(chǔ)備起來(lái)；②DMEM，胰蛋白酶，由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；③胎牛血清（ fatal bovineserum，F(xiàn)BS）：由杭州四季青生物工程材料研究所生產(chǎn)；④DNA染色試劑：由美國(guó)COULTER公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制：從2012年9月收治的皮膚損傷患者中隨機(jī)選取8例，這些受試患者年齡為5到33歲之間，平均年齡28歲，其中男性5例，女性3例，患者病程均為1～2.5年，如沒有特殊皮膚病經(jīng)歷，不考慮患者的其它疾病。對(duì)這些患者進(jìn)行組織提取，取下的增生性瘢痕組織，放入培養(yǎng)皿中用于細(xì)胞的培養(yǎng)。首先，這些培養(yǎng)皿必須進(jìn)行無(wú)菌消毒，然后將取下的組織在培養(yǎng)皿中漂洗，去除組織上的血污及脂肪，確保瘢痕組織絕對(duì)干凈，表面沒有其他組織成分[2]。接下來(lái)，將洗干凈的瘢痕組織用消毒過的剪刀剪碎成約1mm3的小塊。制備培養(yǎng)液時(shí)，首先將DMEM導(dǎo)入器皿中，然后加入100ml/L胎牛血清、100U/ml的青霉素和100g/L鏈霉素，苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品以1：0.001比例溶解于DMEM培養(yǎng)液中。將塊狀瘢痕組織培養(yǎng)于制備好的DMEM培養(yǎng)液中，放入CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將溫度調(diào)控在37℃。之后等細(xì)胞長(zhǎng)大，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后，取出培養(yǎng)的細(xì)胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，然后以1∶3的方式傳代，并將第3～9代細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸脫氫酶（LDH） 的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以105/ml細(xì)胞含量接種于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，加條件培養(yǎng)基分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為加500μg的苦參堿溶液，含量為300μg/ml；對(duì)照組為加500μl的DMEM 溶液。對(duì)這兩組溶液繼續(xù)培養(yǎng)24h，取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)LDH活性值。

1.2.3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖狀況首先制成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入不同質(zhì)量濃度Mat。同時(shí)另外培養(yǎng)兩組細(xì)胞，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組對(duì)照組，一組對(duì)照組不加Mat，一組對(duì)照組只加培養(yǎng)基，這組為空白對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，加入藥品等待48h之后加5mg/ml的MTT溶液 20L，繼續(xù)放置4h，之后離心，去除上層清液，然后加入DMSO200μl，避光振蕩10min。之后開始測(cè)其細(xì)胞增殖情況，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A0）值，然后參考文獻(xiàn)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)測(cè)其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，從而得出增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖抑制情況。

1.2.4 DNA相對(duì)含量測(cè)定得到的細(xì)胞樣品用離心機(jī)離心，然后去除上清液。然后進(jìn)行細(xì)胞洗滌，采用PBS洗滌。再加1mlPBS和2ml無(wú)水乙醇，然后將細(xì)胞冷藏，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 PCNA檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，分2組，分別加入苦參堿培養(yǎng)液和空白培養(yǎng)液；24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性樹脂粘片，PBS沖洗振蕩三次，加入1%過氧化氫，甩干加E抗，4℃放置10h，復(fù)溫1h，PBS沖洗振蕩三次。甩干加I抗，37℃放置1h，PBS沖洗振蕩3次，甩干，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 LDH測(cè)定結(jié)果加入苦參堿作用24h后培養(yǎng)上清液中LDH與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05），見表1，說明藥物含量≤300μg/ml無(wú)細(xì)胞毒作用。

2.2 Mat對(duì)成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒作用成纖維細(xì)胞經(jīng)Mat處理48h后，經(jīng)MTT 法檢測(cè)，活細(xì)胞數(shù)明顯減少，半數(shù)抑制濃度IC50值為1.25mg/ml，與對(duì)照組相比差異顯著，見表2。

2.3 對(duì)細(xì)胞DNA含量及細(xì)胞周期的影響苦參堿對(duì)DI影響不明顯，各時(shí)期細(xì)胞分布為G0～G1期細(xì)胞略有降低，S期細(xì)胞比例明顯減少，G2～M期細(xì)胞比例明顯增多；與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.01）。見表3。

2.4對(duì)PCNA表達(dá)的影響將對(duì)照組和和苦參堿組的成纖維細(xì)胞進(jìn)行PCNA的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為對(duì)照組成纖維細(xì)胞的胞核多呈深棕黃色，而苦參堿組的成纖維細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)多重顏色，且顏色深淺不一，顏色深淺與用藥濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著用藥濃度的增加，顏色逐漸變淺。詳見圖1，2。

3 討論

多年以來(lái)，醫(yī)學(xué)工作者從來(lái)都沒有停止過對(duì)治療增生性瘢痕的有效方法的探究，盡管現(xiàn)在出現(xiàn)了一些治療手段，比如傳統(tǒng)的治療方法，包括手術(shù)切除，類固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑治療及放射療法等等。但這些方法應(yīng)用于臨床之后，患者出現(xiàn)很多不良反應(yīng)，恢復(fù)效果不理想，因此，這些治療方法并不為人們所熱衷，醫(yī)學(xué)工作者通過多年努力，發(fā)現(xiàn)中藥治療可以作為治療增生性瘢痕的有效途徑一直在尋找治療瘢痕的有效途徑。故從中藥中提取出療效確切、副作用小的對(duì)抗增生性瘢痕的藥物具有重要的臨床意義[3]。從中藥苦參中提取的苦參類生物堿是以苦參堿為代表的、化學(xué)結(jié)構(gòu)為四環(huán)喹嗪啶類稠合體的一類生物堿。醫(yī)學(xué)工作者通過大量的臨床試驗(yàn)，證明苦參堿能抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖，從而具有治療瘢痕增生的皮膚性疾病的作用?？鄥A類化合物因?yàn)槠洫?dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，被人們所充分關(guān)注，對(duì)于成纖維細(xì)胞有著重要的藥理作用，值得我們進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

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[2]李曉靜，孟剛，寧金龍，等.瘢痕微血管構(gòu)筑對(duì)瘢痕形成發(fā)展及臨床防治的基礎(chǔ)研究[J].現(xiàn)代康復(fù)，2001，10（1下）：44-45.

[3]李丹，王平全，張楠森.苦參類生物堿的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].中草藥，1996，27（5）：308.

[收稿日期]2013-04-23 [修回日期]2013-06-03

編輯/張惠娟