[摘要]目的：探討Q-開關 Nd：YAG激光不同能量照射黃褐斑動物模型對表皮黑素細胞周期與凋亡的影響。方法：用Q-開關激光不同能量照射黃褐斑動物模型，取表皮黑素細胞進行細胞培養(yǎng)，光學顯微鏡觀察黑素細胞形態(tài)學變化，流式細胞儀檢測照射后細胞周期與凋亡。結(jié)果：軟件分析結(jié)果顯示，除高能高頻組外Q-開關Nd：YAG 1064nm 激光第一次照射后即刻各能量密度與頻率組黑素細胞形態(tài)、細胞周期與凋亡無明顯改變。第5次激光照射后即刻，高能高頻、高能低頻和低能高頻組與照射前比較樹突數(shù)量明顯減少和長度明顯縮短，S期細胞比率減少，凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。照射后1周各組數(shù)據(jù)更加顯著，隨后照射后3周又呈明顯上升趨勢。低能低頻照射組照射前后無顯著差異（P>0.01）。結(jié)論：當激光能量和頻率達到一定閾值時能使黑素細胞體積變小、樹突數(shù)量減少、長度縮短、S期細胞比率減少、凋亡率顯著增加。為臨床應用Q-開關1064nm Nd：YAG激光治療色素性疾病提供了實驗依據(jù)。

[關鍵詞]激光；黑素細胞；細胞周期；細胞凋亡

[中圖分類號]R758.4+2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）12-1286-05

通過Q-開關激光技術(shù)的應用和選擇性光熱作用原理的提出，咖啡斑、黃褐斑等色素增加性皮膚病的治療取得令人滿意的療效[1-2]，現(xiàn)階段人們對Q開關Nd：YAG 1064nm激光的治療原理的認識尚僅局限于黑素顆粒對光的選擇性吸收，而除此之外對激光照射引起的光生物學作用和細胞凋亡和周期并不清楚。但現(xiàn)己明確兩者是密切相關的，阻斷細胞增殖周期過程可引起凋亡，而凋亡常伴隨有生長阻滯[3]。而臨床需要我們對激光照射后黑素細胞周期與凋亡深入研究尤為重要，因此，我們通過實驗研究初步探討Q開關 Nd：YAG激光不同能量照射黃褐斑動物模型對表皮黑素細胞周期與凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物： 根據(jù)文獻[4]制作慢性應激肝郁型豚鼠黃褐斑實驗動物模型12只。

1.1.2主要試劑和儀器：RPMI1640培養(yǎng)基、標準胎牛血清、鏈霉素青霉素雙抗、CT、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（美國 GIBCO公司）；HMGS 添加劑（美國Cascade Biologics公司）；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、0.25%胰蛋白酶、左旋多巴（美國Sigma公司）；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒及細胞周期檢測試劑盒（美國Bender Medsystems公司），bFGF（珠海東大制藥）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光純藥株式會社）；ABC試劑盒（博士德）； 酶聯(lián)免疫分析儀（美國Bio-Rad公司）；臺式微型離心機上海安亭科學儀器廠； CO2培養(yǎng)箱北京利康儀器科技發(fā)展有限公司；流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG激光儀（Medlite C6，美國HoYa-ConBio公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 照射方法：取慢性應激肝郁型豚鼠黃褐斑實驗動物模型造模12只，將每只豚鼠裸露皮膚（8cm×8cm）劃分成A（左上區(qū)域）、B（右上區(qū)域）、C（左下區(qū)域）、D（右下區(qū)域）四個區(qū)域。分別代表不同參數(shù)治療區(qū)。A區(qū)代表高能量低頻率區(qū)：3mm光斑 2.5J/cm2，頻率1Hz；B區(qū)代表高能量高頻率區(qū)：3mm光斑，2.5J/cm2，頻率10Hz；C區(qū)代表低能量高頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率10Hz；D 區(qū)代表低能量低頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率1Hz。每組照射1min，每周照射一次，共照射5次。實驗設每只豚鼠自身激光術(shù)前為對照。

1.2.2 取材方法：分別于激光治療術(shù)前，第1次術(shù)后即刻、第5次術(shù)后即刻、術(shù)后1周、術(shù)后3周五次分別切取不同治療區(qū)約1cm×0.2cm全層去毛皮膚一條，術(shù)后絲線縫合。根據(jù)組織病理和細胞培養(yǎng)觀察需要進行處理保存。

1.2.3 標本的分離和細胞懸液的制備[5-6]：取下的豚鼠皮膚組織用0.05%洗必泰浸泡消毒10 min；生理鹽水漂洗數(shù)遍，剪成5mm×2mm的小塊；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用鑷子將表皮與真皮分離；將表皮組織置于0.25%的胰蛋白酶中室溫消化10 min；用吸管反復吹打成單細胞；待瓶內(nèi)液體混濁時加入與胰酶等量的含10%胎牛血清終止消化；100目篩網(wǎng)過濾；吸取細胞懸液于離心管中，1 000r/min 離心10min ；棄上清， 加入RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，1 000r/min 離心10min；棄上清， 加入黑素細胞培養(yǎng)液（MGM，用RPMI1640培養(yǎng)配制，內(nèi)含20um/mlbF GF、10%FCS、CT250ng/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、氫化考的松3μg/ml、胰島素0.15U/ml、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素）培養(yǎng)。吹打成單細胞懸液，計數(shù)細胞。

1.2.4 傳代培養(yǎng)：將上述制備的細胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，調(diào)整密度為2×104/cm2，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h首次換液，每48h換液1次。當細胞生長至70%～80%融合時進行傳代。每一次實驗取自同一傳代細胞，取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化，臺盼藍染色法計數(shù)活細胞數(shù)，根據(jù)實驗需要分別接種于96孔板（密度為2×104/ml，每孔100μl，每組設3個復孔）與直徑60mm 培養(yǎng)瓶（密度為1×106/ml），繼續(xù)培養(yǎng)48h 后以備下列實驗所用。

1.2.5 L-Dopa染色鑒定與黑素細胞數(shù)量和樹突長度的測定[7]：取對數(shù)生長期培養(yǎng)的黑素細胞用2%多聚甲醛室溫固定15min后雙蒸水清洗3次，最后每孔加入150μl 0.1% 的DOPA溶液，37℃孵育5h后用連接數(shù)字成像系統(tǒng)的倒置顯微鏡觀測，計數(shù)每個培養(yǎng)孔中DOPA陽性細胞的總數(shù)。運用成像系統(tǒng)計數(shù)每個黑素細胞的樹突數(shù)量，規(guī)定樹突的一級結(jié)構(gòu)是與細胞體相連，二級結(jié)構(gòu)與一級結(jié)構(gòu)相連，以此類推。每單個樹突的長度用Axiovisim4.0軟件進行測量，結(jié)果分別以平均每單個DOPA陽性細胞的樹突數(shù)量和長度表示。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期與凋亡：取接種于培養(yǎng)瓶中的黑素細胞，用0.25%不含EDTA 的胰酶消化制成細胞懸液，900rpm 離心5min，PBS 洗滌二次，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度每樣0.1ml 含（1～5）×106個細胞。周期分析采用PI單染，將收集好的細胞加入2ml 75%的酒精固定2h，離心棄上清，PBS 洗滌二次，10mg/L的PI溶液重懸細胞，常溫孵育30min 后進行檢測。采用AnnexinV-FITC 和碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞凋亡，收集細胞后用400μl Binding Buffer懸浮細胞依次加入各10μl AnnexinV-FITC 和PI 混勻，室溫避光反應10min 后上機進行檢測，每一實驗重復3 次，設立治療前組為陰性對照，用Elite 軟件進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：SPSS17.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量數(shù)據(jù)采用t檢驗。組間差異運用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 L-Dopa染色鑒定與黑素細胞數(shù)量和樹突長度的測定：激光照射前可見細胞質(zhì)及樹突呈棕褐色或黑色，多巴染色結(jié)果呈陽性。軟件分析結(jié)果顯示，各組Q開關Nd：YAG 1064 nm 激光第一次照射后即刻高能高頻組與照射前相比多巴陽性細胞數(shù)、樹突長度和數(shù)量輕微減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其他三組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； 第5次激光照射后即刻，高能高頻和高能低頻照射組與照射前相比多巴陽性細胞數(shù)、樹突長度和數(shù)量明顯減少，差異顯著有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低能高頻組與照射前相比多巴陽性細胞數(shù)輕微減少，樹突長度和數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；激光照射后一周更加顯著。激光照射后三周，高能高頻組、高能低頻和低能高頻組黑素細胞較第5次激光照射后一周體積變大，樹突長度和數(shù)量增加。差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。低能低頻組經(jīng)過次照射后無明顯變化；各組間比較：第一次激光照射后即刻高能高頻組與其他組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其他三組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；第5次照射后即刻、照射后一周、照射后三周各組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；低能低頻組在每個時間點與其他各組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖1）。

2.2 Q開關 Nd：YAG1064nm激光照射對豚鼠表皮黑素細胞凋亡的影響：流式細胞儀結(jié)果顯示，Q開關Nd：YAG1064nm激光不同能量和頻率組第一次照射后即刻高能高頻組細胞凋亡率為（4.43%±0.75%），與對照組（3.65%±0.29%）相比細胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高能低頻和低能量兩組分別為（3.83%±0.42%、3.70%±0.06%、3.67%±0.05%）與對照組相比細胞凋亡率無明顯差異（P>0.05）。第5次照射后即刻高能量高低頻兩組和低能高頻組細胞凋亡率顯著增加（25.47%±0.43%、23.98%±0.54%、21.67%±1.37%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。照射后一周更加顯著。照射后3周與照射后1周相比細胞凋亡率減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。流式數(shù)據(jù)分析圖可見高能高頻組右上象限壞死細胞增多。圖2。

2.2 Q開關 Nd： YAG1064nm激光照射對豚鼠表皮黑素細胞周期的影響：流式細胞儀結(jié)果顯示，Q開關Nd：YAG1064nm激光不同能量和頻率組照射后，第1次照射后即刻高能量高低頻兩組DNA合成期的細胞數(shù)比率分別為（36.30%±0.25%、39.92%±0.42%）與對照組（42.21%±0.30%）相比輕度減少（P<0.05），而低能量照射兩組（41.86%±0.39%、42.23%±0.39%）則無明顯變化（P>0.05）。第5次照射后即刻高能量高低頻兩組和低能高頻組DNA合成期的細胞數(shù)比率明顯減少（23.60%±0.29%、28.23%±0.35%、36.25%±0.30%），術(shù)后1周更加顯著。低能低頻組經(jīng)5次照射后無明顯變化（P>0.05）。照射后3周與照射后1周相比DNA合成期的細胞數(shù)比率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高能高頻與低能高頻比較DNA合成期的細胞數(shù)比率減少更明顯P<0.05）圖3。

3 討論

皮膚的色素沉著過程不僅需要黑素細胞胞漿內(nèi)黑素體合成黑素，同時需要成熟的黑素體通過樹枝突轉(zhuǎn)輸?shù)街車慕琴|(zhì)形成細胞，進入角質(zhì)形成細胞的黑素體的質(zhì)與量決定皮膚顏色的差異。因此黑素小體向角質(zhì)形成細胞內(nèi)的傳遞也同樣起到了非常重要的作用[8-9]。樹突是黑素細胞的重要形態(tài)學標志，樹突的形態(tài)與長短都將直接影響著黑素小體的轉(zhuǎn)運。為確保黑素小體的運動與傳遞，有效的樹突形成是必須的前提條件。樹突越長越多，向周圍角質(zhì)形成細胞傳遞的黑素則越多。黑素細胞形態(tài)學的觀察表明：Q開關Nd：YAG 1064 nm 激光第一次照射后即刻高能高頻組多巴陽性細胞數(shù)、樹突長度和數(shù)量減少。說明單次激光能量密度達到一定閾值時，可以抑制黑素小體的運動與傳遞。通過5次激光照射后，高能低頻和低能高頻組照射組多巴陽性細胞數(shù)、樹突長度和數(shù)量減少。但低能高頻組多巴陽性細胞數(shù)教高能量兩組輕微減少。由此可以推測，激光同能量不同頻率對黑素細胞的影響也不一樣。并且激光低能量累加到一定閾值時，同樣也能抑制黑素小體的運動與傳遞。而且激光低能量對黑素細胞本身的損傷小于高能量。提示我們臨床中對于色素細胞活性增強性皮膚病可以使用低能量多次治療，避免高能量對黑素細胞的損傷。激光照射后三周，高能高頻組、高能低頻和低能高頻組黑素細胞較第5次激光照射后一周體積變大，樹突長度和數(shù)量增加。說明激光對黑素細胞的抑制作用不是持續(xù)性的，會在一段時間后恢復。也許 這就解釋了為什么激光術(shù)后會出現(xiàn)反跳和復發(fā)的現(xiàn)象。同時也說明了激光對黑素細胞的影響是可逆的，為我們激光術(shù)后色素減退的治療提供了可能性的支持。

大量學者研究表明激光照射對人表皮黑素細胞可能存在著光生物調(diào)節(jié)和生物刺激作用[10-11]，目前，對激光的生物刺激作用一直都沒有合理的解釋。但激光照射不僅可以引起細胞的凋亡，同時還可使細胞周期出現(xiàn)阻滯的不同變化。細胞凋亡和周期結(jié)果顯示，Q開關Nd：YAG1064nm激光不同能量和頻率組照射后，高能高頻組、高能低能組和低能高頻組明顯抑制黑素細胞 DNA 的合成并促進其凋亡。流式數(shù)據(jù)分析圖顯示高能高頻組右上象限壞死細胞增多，說明激光高能量高頻率超過黑素細胞耐受閾值時直接導致黑素細胞的死亡。而壞死細胞隨著能量和頻率降低而減少。曾有學者認為[12]，色素脫失主要是由于黑素細胞的缺失，而不僅僅是黑素細胞功能的障礙，引起黑素細胞丟失的原因可能是凋亡增加。使我們猜想激光術(shù)后色素減退是否因為細胞凋亡導致。具體機制需要進一步證實。Chan等[13]通過動物實驗已經(jīng)證實重復高能量激光照射可以使細胞DNA 受到損傷。該實驗也表明高能高頻照射使黑素細胞 DNA 的合成出現(xiàn)阻滯，并且低能高頻激光通過次數(shù)累加也可以抑制黑素細胞 DNA 的合成。我們已知UVB 對黑素細胞的直接作用主要通過細胞膜上的光受體激活第二信使而起作用[14]，Q開關 Nd：YAG 1064 nm 激光照射光生物學效應作用的分子機制是什么，都需要更多更為深入的實驗研究來解決。

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[收稿日期]2013-04-25 [修回日期]2013-06-14

編輯/張惠娟