脊椎動(dòng)物的骨骼形成是一個(gè)復(fù)雜的過程。從間充質(zhì)細(xì)胞的富集、體節(jié)的形成、軟骨內(nèi)成骨或膜內(nèi)成骨到骨骼的鈣化，軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間總是存在功能的平衡。軟骨內(nèi)成骨作為骨骼形成的一種主要方式，受多種因素的影響，Notch通路在該過程中起到了極其重要的作用。

1 軟骨內(nèi)成骨

脊椎動(dòng)物的骨骼發(fā)育主要有兩種形式：一種是以顱面部骨及鎖骨為代表的膜內(nèi)成骨，還有以中軸骨、四肢骨及顱底骨為代表的軟骨內(nèi)成骨[1]。軟骨內(nèi)成骨發(fā)生在胚胎早期，始于間充質(zhì)細(xì)胞的富集，繼而形成兩種不同的細(xì)胞亞群：一個(gè)群體形成骨骼生長板，即胚胎發(fā)育的一次骨化中心，主要決定了骨的形狀；另外一群體則形成骨骺端關(guān)節(jié)軟骨，又被稱為二次骨化中心，進(jìn)一步限定了骨的形狀和大小[2]。通常，骨的形狀不同，骨化的方式也有所不同，如：四肢的長骨為二次骨化形式，而椎骨則為一次骨化形成。顱底軟骨的形成及骨化類似于四肢骨，以生長板形式進(jìn)行。

在間充質(zhì)細(xì)胞富集區(qū)，中心區(qū)域的細(xì)胞終止增殖，進(jìn)入分化，經(jīng)過前肥大細(xì)胞、肥大細(xì)胞、終末肥大細(xì)胞最終分化為肥大成熟的軟骨細(xì)胞，分泌礦化的細(xì)胞外基質(zhì)即形成軟骨，為下一步的骨化提供模板。軟骨由一層成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞包裹，后者被稱為軟骨膜。當(dāng)間充質(zhì)細(xì)胞分化到肥大細(xì)胞階段，軟骨膜內(nèi)的細(xì)胞開始分化為成骨細(xì)胞，同時(shí)軟骨膜開始轉(zhuǎn)變?yōu)檠茇S富的骨膜，血管進(jìn)入軟骨基質(zhì)中，成骨和破骨細(xì)胞通過血管分布到軟骨基質(zhì)，開始破壞軟骨基質(zhì)同時(shí)分泌骨基質(zhì)，形成松質(zhì)骨，存留在骨膜中的成骨細(xì)胞則分泌高度鈣化的基質(zhì)形成皮質(zhì)骨[1]。

2 Notch信號(hào)通路

胚胎軟骨發(fā)育受復(fù)雜多變的信號(hào)通路綜合調(diào)節(jié)，從現(xiàn)有知識(shí)體系來看，主要包括Ihh、BMP、FGF、Wnt、Notch等信號(hào)通路[1]。其中，Notch通路通過調(diào)節(jié)胚胎期干細(xì)胞的增殖、分化與凋亡過程，參與調(diào)控哺乳動(dòng)物胚胎體節(jié)發(fā)生[3]、胚胎神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的發(fā)育[4]，并在腫瘤的發(fā)生過程中扮演了重要的角色，現(xiàn)在已成為腫瘤治療研究的新靶點(diǎn)[5]。近年來，研究者們開始關(guān)注該通路在骨發(fā)育過程中的作用。Notch基因最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[6]，隨后眾多的研究證明其廣泛存在且高度保守。在哺乳動(dòng)物，Notch受體包括Notch1-4四種，配體主要有Delta-like1、3、4和Jagged1、2共五種。作為一種跨膜蛋白受體，Notch配體首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)錄翻譯形成初級(jí)蛋白并被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，其中的蛋白轉(zhuǎn)化酶（protein convertases）在Notch1初級(jí)蛋白S1位點(diǎn)進(jìn)行剪切，隨后糖基化轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases）對(duì)其進(jìn)行不同的糖基化修飾，從而影響配體和受體結(jié)合后的不同反應(yīng)[6]。Notch與相鄰細(xì)胞上的配體結(jié)合后，膜旁負(fù)性調(diào)節(jié)區(qū)域（juxtamembrane negative control region，NRR）展開，α-secretase識(shí)別該區(qū)域并在S2位點(diǎn)剪切掉Notch的胞外段，隨后γ-secretase在胞內(nèi)段S3位點(diǎn)的剪切最終產(chǎn)生胞內(nèi)片段NICD。NICD直接進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與CSL（DNA結(jié)合蛋白，不同種屬中名稱不同）結(jié)合，然后募集Maml（NICD的共同激活因子）、結(jié)合組蛋白乙?；负秃巳旧|(zhì)改建復(fù)合物等形成復(fù)合體，解除CSL對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄抑制作用，并最終產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[7]。

3 Notch信號(hào)通路對(duì)軟骨內(nèi)成骨的影響

3.1體內(nèi)試驗(yàn)：胚胎12.5天（E12.5）的小鼠前肢芽區(qū)開始出現(xiàn)成軟骨祖細(xì)胞的聚集，此時(shí)整個(gè)干細(xì)胞聚集區(qū)都呈現(xiàn)Notch1陽性信號(hào)，而到16.5天（E16.5），軟骨分化成熟時(shí)，Notch1陽性細(xì)胞只分布于軟骨的邊緣區(qū)域[8]。這提示其可能參與調(diào)控軟骨內(nèi)成骨全過程。進(jìn)一步的模型動(dòng)物研究表明：Notch過表達(dá)（Gain of function）的小鼠總體表現(xiàn)出圓頭短吻、胸廓小、軀干及尾部短的特點(diǎn)，阿辛藍(lán)-茜素紅染色顯示整體軟骨發(fā)育不全，通過軟骨內(nèi)成骨方式形成的骨普遍體積較小且長度不足，肢端幾乎沒有骨化中心存在，且這種轉(zhuǎn)基因小鼠均為胚胎期致死[9-10]。也有研究者通過過表達(dá)配體激活內(nèi)源性Notch通路，進(jìn)一步觀察軟骨內(nèi)成骨過程的變化。研究發(fā)現(xiàn)，在雞胚上肢區(qū)域用逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)Del-1后，早期上肢的發(fā)育形態(tài)并無改變，而在胚胎7天以后，大小上的差異逐漸明顯起來，肢端出現(xiàn)畸形。值得注意的是，Notch通路的配體在脊椎動(dòng)物有五種，其中一種配體的升高并不能全面解釋經(jīng)典Notch通路在軟骨發(fā)育中的作用[11]。因?yàn)椴煌潴w的表達(dá)具有階段性，故以不同配體過表達(dá)方式進(jìn)行研究有利于揭示Notch通路在骨發(fā)育不同階段的影響。這一方面的研究值得進(jìn)一步深入。同時(shí)，因?yàn)镹otch通路在胚胎的各個(gè)系統(tǒng)發(fā)育，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中有重要的作用，因此，全身敲除Notch導(dǎo)致胚胎早期致死，無法進(jìn)行后續(xù)研究，而條件性基因敲除策略或許可以避免這一缺點(diǎn)，為后續(xù)的骨發(fā)育研究創(chuàng)造條件。

3.2體外實(shí)驗(yàn)：間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎肢芽微聚體等原代細(xì)胞有向軟骨細(xì)胞分化的潛能，常被用于軟骨分化機(jī)制的研究。ATDC5細(xì)胞系（小鼠畸胎瘤成纖維細(xì)胞系）在胰島素的誘導(dǎo)下發(fā)生軟骨向分化[12]。ATDC5細(xì)胞在誘導(dǎo)早期即開始表達(dá)Notch1和相應(yīng)的配體Del1[8]，這種表達(dá)的時(shí)間模式與原代細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果相似，也類似于體內(nèi)試驗(yàn)中動(dòng)物早期干細(xì)胞富集區(qū)Notch1的表達(dá)模式[8]。運(yùn)用該體外模型，有利于探索Notch信號(hào)通路對(duì)軟骨向分化調(diào)控的機(jī)制。首先，Notch通路的激活有利于細(xì)胞的增殖：在配體Del的激活Notch信號(hào)通路的情況下，小鼠間神經(jīng)嵴細(xì)胞克隆的直徑明顯增大，細(xì)胞數(shù)目顯著增加[13]。其次，在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，Notch也可調(diào)控體外培養(yǎng)細(xì)胞的軟骨向分化能力。與高表達(dá)Del1的D10細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，ATDC5細(xì)胞軟骨結(jié)節(jié)及細(xì)胞外基質(zhì)形成明顯減少[8]；相反，通過DAPT（γ蛋白酶阻斷劑）阻斷Notch通路后，肢芽微聚體及間充質(zhì)干細(xì)胞中NICD量明顯下降，軟骨向分化能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為軟骨結(jié)節(jié)的表達(dá)增多[14-15]；實(shí)驗(yàn)從正反兩方面說明，Notch信號(hào)通路的激活能維持細(xì)胞系的增殖潛能，抑制軟骨向分化。值得注意的是ATDC5細(xì)胞系軟骨源性的細(xì)胞系，并非多能干細(xì)胞。

同樣，利用JAG1過表達(dá)的質(zhì)粒使hMSC的Notch通路持續(xù)激活，則細(xì)胞會(huì)維持在聚合體狀態(tài)，不再繼續(xù)分化為成熟的圓形肥大細(xì)胞[2]。有趣的是，在小鼠神經(jīng)嵴細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)初始即刻添加Delta-Fc，軟骨結(jié)節(jié)更豐富，24h后再添加相同劑量Delta-Fc，成軟骨情況不會(huì)改善[13]。兩種相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了Notch通路作用時(shí)間及細(xì)胞所處分化階段的重要性。最新的研究對(duì)Notch表達(dá)時(shí)期的重要性進(jìn)行了探索，Rachel等利用人間充質(zhì)干細(xì)胞3D聚體培養(yǎng)進(jìn)行成軟骨向誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Notch通路配體Jag-1及目標(biāo)基因Hey-1的表達(dá)從誘導(dǎo)開始便急劇上升，并在第2天到達(dá)最高值，之后迅速下降，在表達(dá)下降后，才開始出現(xiàn)軟骨分化標(biāo)志物Col-II的上升。利用DAPT早期阻斷Notch通路可有效降低軟骨形成，同時(shí)若誘導(dǎo)后期Jag-1過表達(dá)持續(xù)激活Notch通路，則軟骨的形成受到抑制。Notch通路的早期激活開啟了干細(xì)胞的軟骨向分化，但在分化后期持續(xù)表達(dá)卻能抑制進(jìn)一步分化進(jìn)行，從而維持前體細(xì)胞狀態(tài)[16]。目前，對(duì)Notch通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡作用的研究主要集中在腫瘤發(fā)生發(fā)展領(lǐng)域，Notch通路能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，現(xiàn)已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[17]。而 Notch通路對(duì)ATDC5凋亡影響的初步研究表明其對(duì)凋亡沒有明顯影響[8]。

綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，Notch能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，啟動(dòng)早期分化，維持前體細(xì)胞的干性，抑制細(xì)胞的進(jìn)一步分化成熟，與軟骨內(nèi)成骨過程密切相關(guān)。

4 Notch通路與其他通路的相互作用

作為一條高度保守的重要通路，Notch通路調(diào)節(jié)各個(gè)系統(tǒng)的生長發(fā)育，只依靠自身有限的受體配體作用，不足以解釋其控制發(fā)育過程的復(fù)雜性，因此通路之間的相互調(diào)節(jié)共同作用也是十分重要的。在軟骨發(fā)育中，主要的調(diào)節(jié)通路包括Sox9、BMP、FGF等可能與Notch通路有交互作用。有研究表明，Jag1通過激活Notch通路抑制Sox9的表達(dá)，另一方面，Notch也直接抑制Sox9的目的基因，兩條途徑共同作用抑制hMSC的軟骨向分化[16]。另外，研究發(fā)現(xiàn)FGF2能促進(jìn)小鼠MSC成軟骨向分化，阻斷Notch通路后，其促進(jìn)成軟骨向分化能力減弱，表現(xiàn)為Col-II表達(dá)減少，而利用SU5402阻斷FGF通路后，Del-Fc激活Notch通路可部分解除對(duì)Col-II的表達(dá)抑制，這說明FGF2的部分功能可以通過Notch通路行使[13]。再者，DAPT處理細(xì)胞抑制Notch通路后，BMP4表達(dá)未受影響，但相應(yīng)的下游蛋白Id1表達(dá)卻有了相當(dāng)?shù)纳?，這可能是由于BMP4位于Notch上游并通過其抑制成軟骨向分化過程[14]。很多證據(jù)表明Notch在影響軟骨分化的過程中與其他通路有著密切的聯(lián)系和相互作用，這是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

5 結(jié)論

軟骨內(nèi)成骨過程中，Notch通路作用的細(xì)胞及分子生物學(xué)機(jī)制是非常復(fù)雜的，不同時(shí)期配體的調(diào)控、與其他通路的相互作用等在Notch行使功能時(shí)扮演了重要角色。越來越多的研究表明，Notch通路在控制干細(xì)胞的增殖和軟骨向分化、維持細(xì)胞的干細(xì)胞活性、保持基質(zhì)的平衡方面起了重要的作用，而其中的具體機(jī)制仍有待探索。深入研究Notch通路對(duì)軟骨內(nèi)成骨的影響有利于人們進(jìn)一步理解生命發(fā)展過程，為各種先天性骨、軟骨發(fā)育不全等骨畸形的預(yù)防性診斷及治療開辟途徑。

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編輯/李陽利