[摘要]目的：觀察Q開關(guān)激光不同能量照射對黃褐斑動物模型黑素細(xì)胞的增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響。方法：用Q開關(guān)激光不同能量照射黃褐斑動物模型，取表皮黑素細(xì)胞進行細(xì)胞培養(yǎng)，采用MTT法測定細(xì)胞活力的影響；氫氧化鈉裂解法測定黑素的含量；體外多巴氧化反應(yīng)法測定酪氨酸活性的變化；光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：除高能高頻組外各能量密度和頻率組激光照射后即刻黑素細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。第5次治療后高能量密度照射組明顯可見黑素細(xì)胞數(shù)目減少、體積變小、樹突數(shù)量減少，長度縮短。而低能量高頻率照射組僅黑素細(xì)胞體積變小，樹突數(shù)量減少，長度縮短。與術(shù)前比較，低能量低頻率照射組黑素細(xì)胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性無顯著差異，但其他三組顯著性下降。然而，3周術(shù)后黑素細(xì)胞增殖、黑素含量、酪氨酸活性增強趨勢，有顯著性意義（P

[關(guān)鍵詞]激光；黑素細(xì)胞；黑素生成；酪氨酸酶；動物模型

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）11-1178-06

黑素由位于基底層的黑素細(xì)胞合成，黑素合成的類型和數(shù)量以及在角質(zhì)形成細(xì)胞周圍的分布決定皮膚的顏色[1]，但表皮中過多的黑素會使皮膚顏色變深從而帶來美容問題，黑素合成是酪氨酸酶催化的系列氧化還原反應(yīng)。抑制酪氨酸酶活性和抑制黑素細(xì)胞代謝的物質(zhì)，一直是皮膚美白及治療色素增多性疾病的主要策略[2]。雖然Q開關(guān)激光在治療色素增加性皮膚病取得較好療效[3]，但仍存在色素脫失和治療后反跳的風(fēng)險[4]，查閱文獻，大量實驗研究顯示不同能量密度的Q開關(guān)激光照射體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞對黑素合成、酪氨酸酶活性有一定的影響。但激光對活體表皮黑素細(xì)胞照射的影響和光生物學(xué)作用尚不十分清楚，因此，我們通過動物實驗初步探討Q開關(guān)激光對體內(nèi)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物： 根據(jù)文獻[5]制作慢性應(yīng)激肝郁型豚鼠黃褐斑實驗動物模型12只。

1.1.2主要試劑和儀器：RPMI1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（美國 GibcoBRL 公司）；HMGS 添加劑（美國Cascade Biologics公司）；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、0.25%胰蛋白酶、TritonX-100、NAOH（美國Sigma 公司）；D-Hanks溶液（美國Hyclone公司）；bFGF（珠海東大制藥）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（北方同正公司）；Dispase酶（日本三光純藥株式會社）；ABC試劑盒（博士德）； 倒置顯微鏡（日本Nikon公司），酶聯(lián)免疫分析儀（美國Bio-Rad公司）；臺式微型離心機；紫外分光光度計（美國Beckman Coulter 公司）；Q-switched Nd：YAG 激光儀（Medlite C6，美國HoYa-ConBio公司）

1.2實驗方法

1.2.1照射方法：取慢性應(yīng)激肝郁型豚鼠黃褐斑實驗動物模型造模12只，將每只小鼠背部裸露色斑皮膚（8cm×8cm）劃分成A（左上區(qū)域）、B（右上區(qū)域）、C（左下區(qū)域）、D（右下區(qū)域）四個區(qū)域。分別代表不同參數(shù)治療區(qū)。A區(qū)代表高能量低頻率區(qū)：3mm光斑 2.5J/cm2，頻率1Hz；B區(qū)代表高能量高頻率區(qū)：3mm光斑，2.5J/cm2，頻率10Hz；C區(qū)代表低能量高頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率10Hz；D 區(qū)代表低能量低頻率區(qū)：3mm光斑，1.5J/cm2，頻率1Hz。每組照射1min，每周照射一次，共照射5次。實驗設(shè)每只豚鼠自身激光術(shù)前為對照。

1.2.2取材方法： 分別于激光治療術(shù)前，第1次術(shù)后即刻、第5次術(shù)后即刻、術(shù)后1周、術(shù)后3周五次分別切取不同治療區(qū)約1.0cm×0.2cm全層去毛皮膚一條，術(shù)后絲線縫合。根據(jù)組織病理和細(xì)胞培養(yǎng)觀察需要進行處理保存。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.3.1標(biāo)本的分離和細(xì)胞懸液的制備[6-7]：取下的豚鼠皮膚組織用0.05%洗必泰浸泡消毒10min；生理鹽水漂洗數(shù)遍，剪成5mm×2mm的小塊；0.25%的DispaseⅡ酶4℃消化（16～24h）；用鑷子將表皮與真皮分離；將表皮組織置于0.25%的胰蛋白酶中室溫消化10min；用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞；待瓶內(nèi)液體混濁時加入與胰酶等量的含10%胎牛血清終止消化；100目篩網(wǎng)過濾；吸取細(xì)胞懸液于離心管中，1 000r/min離心10min；棄上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min；棄上清，加入黑素細(xì)胞培養(yǎng)液（MGM，用RPMI1640培養(yǎng)配制，內(nèi)含 20μm/mlbFGF、10%FCS、CT250ng/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、氫化考的松3μg/ml、胰島素0.15U/ml、100 U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素）培養(yǎng)。吹打成單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞。

1.2.3.2 傳代培養(yǎng)：將上述制備的細(xì)胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，調(diào)整密度為2×104/cm2，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h首次換液，每48h換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合時進行傳代。每一次實驗取自同一傳代細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化，臺盼藍染色法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，根據(jù)實驗需要分別接種于96 孔板（密度為2×104/ml，每孔100μl，每組設(shè)3個復(fù)孔）與直徑60mm 培養(yǎng)瓶（密度為1×106/ml），繼續(xù)培養(yǎng)48h后以備下列實驗所用。

1.3 測定方法

1.3.1 黑素細(xì)胞增殖影響的測定[8]：采用MTT法測定，取第2代對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104/ml， 按每孔100μl接種于96孔板，每孔加入20μl MTT溶液（濃度為5g/l，用PBS稀釋）37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150μlDMSO，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，設(shè)立4個實驗組，各組各時間點設(shè)立3個復(fù)孔，術(shù)前單純細(xì)胞（A值）作為對照組，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（A值）。計算黑素細(xì)胞增殖率=照射組值A(chǔ)490/對照組值A(chǔ)490×100%。

1.3.2 黑素細(xì)胞黑素生成影響的測定[9]：采用NAOH溶解法，取第2代對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞，將處理后的黑素細(xì)胞棄去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3min 后，接種及分組同上。然后加入100μl的1mmol/L的NAOH溶液中，37℃孵育1h后，各管加入400μl 的蒸餾水稀釋后，用酶標(biāo)儀測定490nm波長（A）值。根據(jù)公式計算黑素相對含量=照射組值A(chǔ)490/對照組值A(chǔ)490×100%。

1.3.3 黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響測定[8]：氧化多巴反應(yīng)法測定酪氨酸酶活性，細(xì)胞接種與分組同黑素含量測定。取第2代對數(shù)生長期細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，每孔加1%TriontX-100溶液50μl，-80℃凍融使細(xì)胞破裂，加入1%L-DOPA溶液100μl，37℃反應(yīng)3h，酶聯(lián)免疫分析儀測定490nm波長的吸光度值（A）。酪氨酸酶相對活性=照射組值A(chǔ)490/對照組值A(chǔ)490×100%。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察：倒置顯微鏡觀察激光照射后各組培養(yǎng)黑素細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量數(shù)據(jù)采用t檢驗。組間差異運用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Q-switched Nd： YAG 激光照射后對黑素細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察傳代培養(yǎng)的第二代豚鼠黑素細(xì)胞形態(tài)呈樹突狀，兩極或多極，不規(guī)則排列，部分區(qū)域連接成網(wǎng)狀。各組第1次照射后即刻除高能高頻組黑素細(xì)胞輕微減少外無明顯變化，5次激光照射后一周，低能高頻組未明顯可見黑素細(xì)胞減少，但體積變小、樹突長度減少。高能高頻和高能低頻照射組可見黑素細(xì)胞減少、體積變小、樹突長度減少。5次激光照射術(shù)后3周，低能高頻組黑素細(xì)胞體積變大，樹突延長，兩極，三極。低能低頻組經(jīng)過5次照射后無明顯變化（圖1）。

2.2 黑素細(xì)胞增殖的影響：采用重復(fù)測量資料的方差分析，與照射前相比高能高頻組、高能低頻組和低能高頻組黑素細(xì)胞增殖率顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。不同激光照射組在不同時段的變化趨勢不同。高能高頻組與照射前比較在第1次激光術(shù)后即刻黑素細(xì)胞增殖率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能高頻組在第5次術(shù)后即刻黑素細(xì)胞增殖率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。并且不同照射組間下降分值不同，高能高頻組較其他組下降顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能低頻經(jīng)5次照射后與照射前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）見表1、圖2。

2.3 黑素細(xì)胞黑素生成的影響：采用重復(fù)測量資料的方差分析，與照射前相比高能高頻組、高能低頻組和低能高頻組黑素含量顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。不同激光照射組在不同時段的變化趨勢不同。高能高頻組與照射前比較在第1次激光照射后即刻黑素含量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能高頻組在第5次照射后即刻黑素含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。并且不同照射組間下降分值不同，高能高頻組較其他組下降顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能低頻經(jīng)5次照射后與照射前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）見表2、圖3。

2.4黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響：采用重復(fù)測量資料的方差分析，與照射前相比高能高頻組、高能低頻組和低能高頻組酪氨酸酶活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。不同激光照射組在不同時段的變化趨勢不同。高能高頻組與照射前比較在第1次激光照射后即刻酪氨酸酶活性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能高頻組在第5次照射后即刻酪氨酸酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。并且不同照射組間下降分值不同，高能高頻組較其他組下降顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。低能低頻經(jīng)5次照射后與照射前相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）見表3、圖4。

3 討論

近些年，醫(yī)用激光技術(shù)迅猛發(fā)展，在色素性皮膚病的治療中發(fā)揮著非常重要的作用?，F(xiàn)階段Q開關(guān)Nd： YAG激光治療色素增加性皮膚病的機理主要是選擇性光熱作用理論，但Q開關(guān)Nd： YAG激光對黑素細(xì)胞黑素合成影響的機制卻并不清楚。通過不同能量密度的Q開關(guān)Nd：YAG激光對體外培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞照射實驗表明[10]，高能量抑制黑素細(xì)胞的黑素合成，而低能量則促進。動物實驗也表明[11]，激光能量較低時，可促進黑色素合成，能量較高時抑制黑色素的合成。黑素的合成是個極其復(fù)雜的過程，在體內(nèi)受金屬離子、激素、酪氨酸酶等各種因素的調(diào)節(jié)，但體內(nèi)和體外是否存在著差異，為我們提出更多的疑問。但這些結(jié)果和臨床現(xiàn)象為我們的研究提供了理論基礎(chǔ)與實驗手段和思路。本課題中我們通過觀察Q開關(guān)Nd：YAG激光照射活體黃褐斑豚鼠模型，并分次取材培養(yǎng)模型表皮黑素細(xì)胞研究其對細(xì)胞增殖、黑素合成的影響。

實驗結(jié)果顯示與其他組相比高能高頻組經(jīng)第一次照射后即可抑制黑素細(xì)胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。表明在單位時間內(nèi)靶目標(biāo)接受到的照射能量足夠大時，黑素細(xì)胞吸收的累積熱量同樣會達到一定的溫度，從而導(dǎo)致對黑素細(xì)胞的損傷和影響。低能高頻組通過多次照射后才顯示出對黑素細(xì)胞合成功能的抑制作用。表明低能量密度隨著多次能量密度的累加，增強到某一程度時才對黑素細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷或影響。而低能低頻組經(jīng)過5次照射后無明顯變化。更加表明了黑素細(xì)胞是可以耐受一定能量密度范圍內(nèi)的照射。激光照射的能量密度只有累積達到一定閾值時，才會對黑素細(xì)胞產(chǎn)生影響。由此推論不論高能量或低能量當(dāng)超過一定耐受閾值時都會對黑素細(xì)胞產(chǎn)生影響或損傷，不僅是對色素顆粒的爆破，也能抑制黑素細(xì)胞的增殖，降低酪氨酸酶活性及降低黑素合成量。高能量時可能直接導(dǎo)致黑素細(xì)胞的損傷或減少，而低能量照射是能量累積的結(jié)果。從而解釋了臨床上Q開關(guān)Nd：YAG 1064nm 激光大光斑、小能量、多次治療黃褐斑引起色素減退的現(xiàn)象[12]，隨著累加能量的增多，超過了黑素細(xì)胞的耐受閾值。近來大量國內(nèi)外研究表明，大光斑、低能量多次治療與高能量、小光斑少次治療療效一致，但減少了不良反應(yīng)的發(fā)生[13-14]，本研究結(jié)果與之相符。Griflies[15]對2l例黃褐斑患者的研究則認(rèn)為黃褐斑皮損區(qū)黑素細(xì)胞數(shù)量并無改變，其色素增加主要是由于黑素合成及轉(zhuǎn)運障礙的緣故。結(jié)合我們近期臨床使用大光斑，小能量，高頻率，多次治療的方式治療黃褐斑的經(jīng)驗，說明該方法是以通過對黑素細(xì)胞合成功能抑制的原理。

通過術(shù)后3周的觀察，無論高能量還是低能量導(dǎo)致的這種損傷都是可逆性的，黑素細(xì)胞會隨著時間的延長進行自我修復(fù)。另一方面也解釋了在修復(fù)過程中如果黑素細(xì)胞活性增強就有可能出現(xiàn)治療后色素反跳性增加的臨床現(xiàn)象。Liew 等[16]認(rèn)為，激光治療后的色素脫失和色素減退是由于黑素合成的抑制，而并沒有基底層黑素細(xì)胞數(shù)量的改變。但根據(jù)實驗結(jié)果分析，在一定的能量密度和頻率條件下激光不僅破壞了黑素小體，同時還可以明顯抑制黑素的合成。而且過強的能量密度和頻率任然會損傷黑素細(xì)胞，導(dǎo)致色減的發(fā)生。這一點可以提示我們，如果我們在臨床上需要使用高能量對色素顆粒進行爆破時，應(yīng)避免能量過高，減少對黑素細(xì)胞的損傷。通過實驗結(jié)果可以指導(dǎo)我們臨床中面對黑素細(xì)胞合成功能增加色素性疾病時如黃褐斑、PIH等，使用低能量、高頻率多次治療的方法，抑制黑素細(xì)胞的合成功能達到治療目的。僅表現(xiàn)色素顆粒增多色素性疾病如太田痣、褐青色痣等，可以使用高能量、低頻率治療，爆破色素顆粒促進組織吸收。因此臨床上選用Q開關(guān) Nd：YAG 激光治療色素增加性疾病時對于能量密度與頻率的選擇非常重要。

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[收稿日期]2013-04-11 [修回日期]2013-05-26

編輯/張惠娟