[摘要]目的：探討蝦青素對(duì)長(zhǎng)波紫外線（UVA）輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法：采用人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCat細(xì)胞構(gòu)建體外模型，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，酶生化法測(cè)定細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）的活性和丙二醛（MDA）的含量。結(jié)果：蝦青素能提高受UVA輻射的HaCaT細(xì)胞的增殖活力，提高胞質(zhì)SOD和GSH-px的活性，降低細(xì)胞內(nèi)MDA的含量。結(jié)論：蝦青素對(duì)受UVA輻射的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]蝦青素；長(zhǎng)波紫外線；HaCaT細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）11-1175-03

引起皮膚光老化的主要環(huán)境因素是陽(yáng)光中的紫外線輻射（UVR），其中長(zhǎng)波紫外線（UVA，波長(zhǎng) 320～400nm）是引起皮膚老化的最主要因素，它能穿透皮膚角質(zhì)層到達(dá)真皮層，引起真皮層膠原纖維減少和彈力纖維變性，出現(xiàn)特征性的光老化改變[1]。蝦青素是一種含氧的類胡蘿卜素，具有抗氧化功能，能有效清除氧自由基[2]。本實(shí)驗(yàn)主要探討蝦青素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）受UVA輻射損傷后的保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1 主要試劑：蝦青素：純度≥98%，美國(guó)SIGMA公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國(guó)GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）粉：美國(guó)Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒和考馬斯蘭蛋白測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞來(lái)源：HaCaT細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：采用胎牛血清培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，傳代時(shí)用胰蛋白酶進(jìn)行消化。將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、UVA損傷組、UVA+0.1μg/L蝦青素組、UVA+1μg/L蝦青素組、UVA+10μg/L 蝦青素組、UVA+100μg/L蝦青素組。

1.3.2 MTT法測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖活性：將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，密度為104個(gè)/ml。按上述方法進(jìn)行分組，每組4個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度蝦青素。孵育12h后倒去培養(yǎng)基，使用PBS液沖洗3次，再次加入PBS液，采用強(qiáng)度為18J/cm2的UVA進(jìn)行照射（除空白對(duì)照組外）。照射后倒去PBS液，繼續(xù)用原培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，各孔加入MTT（濃度5mg/ml）20μl，孵育4h，吸去上清，加入200μl二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩15min。選擇波長(zhǎng)490nm在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.3 SOD、GSH-px活性測(cè)定和MDA含量測(cè)定：仍按上述方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組及UVA輻射處理，取經(jīng)UVA輻射后繼續(xù)培養(yǎng)12h的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，離心5min（1000r/min），吸去上清，冷無(wú)菌雙蒸水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，按照考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）測(cè)試盒及丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，分別于595nm、550nm、412nm、532nm處測(cè)定各組細(xì)胞的OD值，按公式計(jì)算出各組樣本的蛋白含量、SOD活性、GSH-px活性以及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0軟件，計(jì)量資料用（x±s）表示，對(duì)所得結(jié)果采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 蝦青素對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響：與空白對(duì)照組比較，除UVA+100μg/L 蝦青素組外，其余各組細(xì)胞的增殖活力（用OD值表示）明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組細(xì)胞的增殖活力明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，除UVA+1μg/L蝦青素組和UVA+10μg/L蝦青素組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 蝦青素對(duì)HaCaT細(xì)胞抗氧化應(yīng)激作用的影響

2.2.1 SOD活性測(cè)定結(jié)果分析：與空白對(duì)照組比較，各組細(xì)胞的SOD活性均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組細(xì)胞的SOD活性均明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；此外，除UVA+ 1μg/L 蝦青素組和UVA+10μg/L 蝦青素組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.2 GSH-px活性測(cè)定結(jié)果分析：與空白對(duì)照組比較，各組的GSH-px活性均有所下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組的GSH-px活性均明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，除UVA+1μg/L 蝦青素組和UVA+10μg/L 蝦青素組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2.3 MDA含量測(cè)定：與空白對(duì)照組比較，其余各組的細(xì)胞MDA含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，其余各組的細(xì)胞MDA含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；此外，余下各組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

皮膚衰老通常分為內(nèi)源性老化（自然老化）和外源性老化（主要為光老化）。暴露部位皮膚的老化約90%是由紫外線的光老化（photoaging）作用引起。由于UVA對(duì)皮膚的穿透能力高于UVB，能穿透至真皮，引起膠原纖維和彈力纖維的損傷，故UVA在皮膚光老化發(fā)病中的作用日益受到重視[3-4]。UVA尤其是UVA1（340～400nm）照射可使皮膚細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）[5-6]，當(dāng)產(chǎn)生的ROS超過(guò)細(xì)胞所能消除的能力時(shí)，氧化與抗氧化平衡被打破，氧化應(yīng)激發(fā)生，造成細(xì)胞凋亡、甚至死亡[7-8]。目前已有較多研究證實(shí)某些物質(zhì)成分對(duì)UVA引起的光損傷具有保護(hù)作用，如黃芪、人參、杜仲、絞股藍(lán)、紅景天等，其作用機(jī)制主要通過(guò)抗氧化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[9]。而一些研究表明部分抗氧化劑如Ectoin（一種埃及水域植物）、茶葉提取物、番茄紅素、水龍骨屬植物提取物、N-乙酰基半胱氨酸等具有一定的預(yù)防皮膚光老化作用[10-12]。

蝦青素作為一種類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的海洋動(dòng)物體、藻體及部分陸生植物體內(nèi)，其尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出[13]。蝦青素能淬滅單線態(tài)氧，并有效清除氧自由基，類似維生素E，為脂溶性抗氧化劑，但其抗氧化活性高于VE，也高于β-C、玉米黃素、葉黃素和角黃素等類胡蘿卜素[14]。然而蝦青素在皮膚光老化中的作用研究較少，僅有個(gè)別研究指出某種含有蝦青素成分的脂質(zhì)體配方外用，對(duì)紫外線引起的皮膚損傷具有保護(hù)作用[15]。而關(guān)于蝦青素對(duì)UVA輻射后角質(zhì)形成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其可能相關(guān)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在建立UVA輻射人角質(zhì)形成細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，探討蝦青素對(duì)體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞受到UVA輻射損傷后的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制。

MTT法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法，本研究結(jié)果顯示除大劑量蝦青素（100μg/L）組外，經(jīng)UVA輻射后HaCaT細(xì)胞的增殖活力明顯下降；而與UVA損傷組比較，除最小劑量蝦青素（0.1μg/L）組外，其余各組細(xì)胞增殖活力明顯提高，提示：蝦青素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞受UVA輻射損傷具有防護(hù)作用，劑量越大，細(xì)胞的增殖活力越強(qiáng)。SOD和GSH-px是機(jī)體廣泛存在的兩種重要的抗氧化酶，可以保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受紫外線介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，常用來(lái)反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，從而間接地反映出細(xì)胞損傷的程度。本研究結(jié)果表明，UVA輻射可抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞SOD和GSH-px的活性， 導(dǎo)致細(xì)胞MDA含量明顯增加，但在預(yù)先給予蝦青素后，可使細(xì)胞SOD和GSH-px的活性明顯升高， 細(xì)胞MDA含量明顯減少，并且在劑量為100μg/L時(shí)，效果最好。說(shuō)明蝦青素對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞受到UVA輻射后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，并在高濃度時(shí)達(dá)最佳效果。

綜上可見(jiàn)，UVA輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞具有損傷作用，而蝦青素對(duì)受UVA輻射的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的防護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)清除氧自由基，提高抗氧化酶的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由此我們推斷，蝦青素在一定程度上可以對(duì)抗光老化導(dǎo)致的皮膚衰老。但本實(shí)驗(yàn)僅為角質(zhì)形成細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，尚需進(jìn)一步通過(guò)活體研究來(lái)證實(shí)此保護(hù)效應(yīng)。

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[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-05-26

編輯/張惠娟