摘要：建立了植物甾醇酯的分析方法，包括植物甾醇酯中的總甾醇、游離甾醇和甾醇酯含量的分析。樣品通過與KOH皂化，提取出植物甾醇，進(jìn)行氣相分析。采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定總甾醇和游離甾醇含量，通過計(jì)算得到甾醇酯含量。結(jié)果表明，此方法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，分離度和重復(fù)性較好，準(zhǔn)確度高。

關(guān)鍵詞：植物甾醇酯 總甾醇 內(nèi)標(biāo)法

中圖分類號(hào)：TQ645.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）18-0016-03

植物甾醇是從植物油工業(yè)副產(chǎn)物中得到的一種具有多種生理活性的天然活性物質(zhì)，主要功效在于可降低人體低密度脂蛋白水平[1]并有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化和抗炎等功能[2]。但是由于植物甾醇的疏水性和弱油溶性導(dǎo)致了其在人體內(nèi)的溶解性和生物利用性較差[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸和植物甾醇結(jié)合形成的不飽和脂肪酸植物甾醇酯可以提高植物甾醇的油溶性，并且安全性更高[4]，應(yīng)用范圍更廣。由于植物甾醇酯的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，傳統(tǒng)的一些甾醇分析方法并不能夠滿足應(yīng)用的需求，因此建立方便快捷的植物甾醇酯分析方法日趨重要。傳統(tǒng)對(duì)甾醇的分析方法主要是毛地黃皂甙法、酶法、薄層色譜法、高效液相色譜法[6]、氣相色譜[7]等方法，其中氣相色譜分析法對(duì)各甾醇組分分離度較好，但需要經(jīng)過衍生化處理導(dǎo)致步驟比較繁瑣，另外，植物甾醇酯的沸點(diǎn)很高需要采用高溫色譜柱來(lái)分析[8]，這對(duì)設(shè)備的要求很高且色譜柱損耗大進(jìn)一步提高了分析成本。鑒于此，本文中采用的方法的優(yōu)勢(shì)在于植物甾醇酯樣品經(jīng)處理后，不需衍生化，可直接用氣相色譜分析植物甾醇酯中總甾醇含量和游離甾醇含量并且對(duì)設(shè)備要求低，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水乙醇（AR）、KOH（AR）、硫酸（AR）、丙酸酐（AR）、吡啶（AR）購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；植物甾醇（95）購(gòu)于江蘇春之谷生物制品有限公司；植物甾醇酯（95）購(gòu)于cognis生物制品有限公司；膽固醇（95）購(gòu)于湖南湘原植物生化有限公司；N，0一雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（簡(jiǎn)稱BSTFA）（98）購(gòu)于上海益民化工有限公司。

1.2 主要儀器

Agilent 6820氣相色譜儀，Agilent Technol-ogies Inc；

氫火焰離子化檢測(cè)器，Agilent Technologies Inc；

DB-5高溫色譜柱（0.32*30），Agilent Technologies Inc；

PL203電子精密天平，梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司；

水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 氣相色譜分析條件

檢測(cè)器：FID，溫度300℃；

氣體流量：氫氣30mL/min，空氣300mL/min，載氣：氮?dú)猓?5mL/min；

進(jìn)樣溫度300℃；

分流進(jìn)樣，分流比為50：1；

柱溫（程升）：起始溫度180℃，保持1min，以5℃/min升溫至260℃，保持20min；

進(jìn)樣量0.6 L，柱壓10psi。

1.4 樣品的處理

1.4.1 植物甾醇95的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

稱取0.05 g植物甾醇95配成25mL濃度為2mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；稱取0.05g內(nèi)標(biāo)物配成25mL濃度為2 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物溶液；分別取標(biāo)準(zhǔn)品1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、4mL加入1mL內(nèi)標(biāo)物溶液后稀釋到5mL，進(jìn)樣量為0.6μL。

1.4.2 總植物甾醇含量的測(cè)定

在250ml錐形瓶中加入0.3500g植物甾醇酯樣品、 0.06g膽固醇內(nèi)標(biāo)物、5g氫氧化鉀和50ml無(wú)水乙醇，在79℃下回流攪拌30分鐘后向反應(yīng)瓶中加入25ml水并用25ml正己烷萃取靜置分層。最后，取2mL的上層液稀釋4倍后進(jìn)行氣相檢測(cè)（進(jìn)樣量為0.6μL），測(cè)定樣品中總甾醇含量。

1.4.3 游離植物甾醇含量的測(cè)定

稱取樣品0.5000g，加入0.01g膽固醇內(nèi)標(biāo)物以及10mL正己烷，稀釋3倍后進(jìn)行氣相檢測(cè)，測(cè)定樣品中游離甾醇的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜分析條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇

植物甾醇屬于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)，必須選擇能耐高溫、有良好惰性的柱子。本文采用具有以上特性的DB-5色譜柱（30m×0.32mm×0.10μm）。

2.1.2 程序的選擇

程序升溫速度應(yīng)該適當(dāng)，過快會(huì)使植物甾醇中各組份無(wú)法完全分離而過慢會(huì)使分析時(shí)間變長(zhǎng)，峰型也較差。起始溫度考查了160℃-210℃，最終確定的最適合溫度為180℃，保持1min。另外，升溫速率考查了3℃/min、5℃/min和10℃/min，并確定了5℃/min的最佳升溫速度，在此升溫程序下的植物甾醇分離效果好，出峰時(shí)間適合。最后當(dāng)程序升溫至260℃時(shí)保持20min。

2.2 衍生化方法的選擇

分別考查了用丙酸酐酰化衍生化法、MSTFA硅烷化衍生化法及直接進(jìn)樣法對(duì)分析結(jié)果的影響。

丙酸酐衍生化法在吡啶溶劑下進(jìn)行，回流10分鐘，最終的氣相色譜分析表明衍生化不完全（如圖1），且溶劑用吡啶污染大；

MSTFA硅烷化試劑衍生化在正己烷溶劑下進(jìn)行，70℃衍生化35分鐘，氣相色譜分析表明其衍生化也不完全（如圖2）；

最后，在不衍生化直接進(jìn)樣條件下的分析結(jié)果顯示（如圖3），植物甾醇的分離度良好，峰型較好，重復(fù)三次的結(jié)果基本一致，表明直接進(jìn)樣的方式適用于植物甾醇的氣相色譜分析。

2.3 內(nèi)標(biāo)物的選擇

總植物甾醇定量分析采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，選用與植物甾醇性質(zhì)相同的膽固醇作內(nèi)標(biāo)物。在氣相色譜分析中膽固醇的出峰與其它峰能完全分開，峰型好，不拖尾而且試劑價(jià)格便宜，因此相比較而言膽固醇是一種理想的內(nèi)標(biāo)物。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液中植物甾醇與加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比（ΣM/Ms）作為橫坐標(biāo)（X），植物甾醇各組分峰面積之和與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（ΣA/As）作為縱坐標(biāo)（Y），從而得到植物甾醇與內(nèi)標(biāo)物的相關(guān)曲線，其線性回歸方程為：Y=1.2168X+0.0127，R=0.9988，具有良好的現(xiàn)性關(guān)系。

2.5 樣品分析

2.5.1 總植物甾醇的計(jì)算

按1.4.2中的方法處理樣品，測(cè)得Y=3.162，計(jì)算得出X=3.488，根據(jù)總植物甾醇含量（C）=X×Ms/m，得出C=59.8%；其中：C為總植物甾醇含量；m為甾醇酯樣品的質(zhì)量

2.5.2 游離植物甾醇的計(jì)算

按1.4.3中的方法處理樣品，測(cè)定Y=0.589，計(jì)算得出X=0.065，因此，游離植物甾醇含量（c）=1.3%其中：c為游離植物甾醇含量。

2.5.3 植物甾醇酯含量的計(jì)算

由于植物甾醇酯轉(zhuǎn)化來(lái)的植物甾醇含量W=C-c= 59.8%-1.3%=58.5%；則植物甾醇酯含量Z=W×672/410 ×100%=95.9%，結(jié)果與樣品提供的檢測(cè)報(bào)告相符。其中：672為植物甾醇酯的平均分子量，410為植物甾醇的平均分子量。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)植物甾醇酯樣品的分析方法進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，最終確定了選擇DB-5色譜柱，采用程序升溫的方法，不需要衍生化，并確定了以膽固醇為內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析樣品中總植物甾醇和游離植物甾醇，計(jì)算得出植物甾醇酯的含量。該方法條件溫和，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好適用于植物甾醇酯樣品的分析。

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