摘要：本研究以制備的抗菌肽為主要成分，配合乳酸鏈球菌素、溶菌酶、EDTA 二鈉四種常用添加劑，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得一種防腐效果優(yōu)良的復(fù)合防腐劑配方。實(shí)驗(yàn)證明，能有效地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、熒光假單胞桿菌、藤黃微球菌等多種細(xì)菌的生長(zhǎng)、效果良好；說(shuō)明其能用于冷卻肉的防腐保鮮。

關(guān)鍵詞：復(fù)合防腐劑 食品防腐 正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）18-0068-02

隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的關(guān)注度越來(lái)越高，食品添加劑的使用也越來(lái)越謹(jǐn)慎，人們逐漸追求更加健康安全天然的食品防腐劑?？咕膩?lái)源廣泛，可從多種動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)生成并提取抗菌肽，如家蠅等?？咕氖嵌嚯念愇镔|(zhì)，穩(wěn)定性好、易溶解、具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性（能有效抑制多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌及部分真菌的生長(zhǎng)）[1]。一般研究認(rèn)為，抗菌肽能破壞菌體細(xì)胞膜致其穿孔溶解從而達(dá)到殺菌作用；也有研究證明，抗菌肽在橙汁[2]、冷卻肉[3]中保鮮效果顯著，可用作食品防腐劑。

然而，由于抗菌肽的制備成本還比較高，將純品直接用于防腐劑成本過(guò)高，不利于規(guī)?；褂?，而抗菌肽的實(shí)際應(yīng)用還不多。安全性較高的天然防腐劑如nisin、溶菌酶等對(duì)G-菌的抵抗能力較弱，一定程度上局限了它們的使用。另一方面，EDTA能螯合離子，有實(shí)驗(yàn)證明可以提高多種防腐劑的防腐保鮮效果[1，2]。因此，探討一種以抗菌肽為主要成分的復(fù)合防腐劑，既能降低防腐劑的用量、減少成本、提高安全性，又能提高防腐保鮮效果，很有必要。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

抗菌肽粉末樣品（經(jīng)針刺蠅蛹誘導(dǎo)產(chǎn)生并提取制備、分離純化后凍干成淡黃色粉末備用，方法同文獻(xiàn)[1]）、乳酸鏈球菌素nisin、溶菌酶、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA二鈉），將物質(zhì)溶于無(wú)菌蒸餾水或稀HCl中；96孔板、紫外分光光度計(jì)、自動(dòng)酶標(biāo)儀、微量移液器、電熱恒溫培養(yǎng)箱。

菌種：金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus （S.aureu）、藤黃微球菌Micrococcus luteus（M.luteus）、大腸桿菌Escherichia coli ATCC8739（E.coli）、熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens（P.fluorescens）。將四種細(xì)菌接種至LB（液）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8～10h，3000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，沉淀的菌體用培養(yǎng)基稀釋至106CFU/ml，菌液備用。

2 方法

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以抗菌肽物質(zhì)H、nisin（N）、溶菌酶（L）、EDTA（E）的濃度為四因素，根據(jù)它們的最低抑菌濃度（MIC）各設(shè)置三水平（其中H的三個(gè)水平分別為：0.1、0.2、0.3mg/mL，N的三水平依次是：0、0.1、0.2mg/mL，L的三水平是：0、0.1、0.2 mg/mL ，E的三水平是：0、0.05、1 mg/mL）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，考慮H×E，N×L，L×E 的交互作用，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)表（L27（313）正交表），表頭如圖1：

以物質(zhì)對(duì)四種微生物的抑制作用（24h內(nèi)微生物A630值的增長(zhǎng)量）為響應(yīng)指標(biāo)。

2.2 A630值增長(zhǎng)值測(cè)定方法

用滅菌蒸餾水稀釋適量的待測(cè)樣品（終濃度為正交表中的濃度），取20μl加至96孔板的對(duì)應(yīng)孔中；然后加入菌液 80μl后，37℃培養(yǎng)，分別于0h、6h、12h、24h、48h時(shí)，測(cè)定吸光值A(chǔ)630。分別計(jì)算各自24h內(nèi)微生物A630的增長(zhǎng)值。其中，空白對(duì)照組加入20ul菌液，陽(yáng)性對(duì)照組加入20ul 20ug/mL Amp，陰性對(duì)照組加入20ul溶劑中對(duì)應(yīng)濃度的乙酸。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用極差分析確定影響因素的主次關(guān)系，利用方差分析確定各影響因素引起的差異是否顯著。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果與分析

（1）正交試驗(yàn)中1-27組實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)指標(biāo)A630值的增長(zhǎng)量分別為：（見(jiàn)表1）

（2）正交試驗(yàn)極差和方差分析。

金黃色葡萄球菌：極差分析說(shuō)明影響抗菌效果的因素有主到次是：抗菌肽H濃度、EDTA濃度、H×E、N×L、L×E、N、L，其中抗菌肽H濃度、EDTA濃度和H×E兩者的交互作用是最主要因素，能有效提高抗菌效果，起到防腐作用。

大腸桿菌：極差分析顯示，抗菌肽H能顯著提高抗菌效果。其他因素的影響差別不大。

熒光假單胞桿菌：極差分析顯示，抗菌肽H能顯著提高抗菌效果，EDTA濃度和H×E交互作用對(duì)抗菌效果也有一定影響。

藤黃微球菌：抗菌肽H顯著提高了抗菌效果，而EDTA濃度、H×E和N×L交互作用的影響比較明顯，表明nisin、溶菌酶、EDTA的使用，能有效提高物質(zhì)的防腐抗菌效果。

綜合考慮抗菌效果、成本等方面因素，能起到較好抗菌效果的防腐劑復(fù)配組合是：H3L1N3E3，即抗菌肽H濃度0.3mg/mL、溶菌酶濃度0.2mg/mL、EDTA濃度1mg/mL。

進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果顯示該濃度抗菌效果較好，能有效的抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、熒光假單胞桿菌、藤黃微球菌，這些都是食品常見(jiàn)的腐敗菌，表明該復(fù)合物能用作食品防腐劑，效果良好。

3.2 討論

以抗菌肽為主要成分，結(jié)合Nisin、溶菌酶、EDTA的使用，能有效提高物質(zhì)的防腐抗菌效果，這與文獻(xiàn)[5]的結(jié)果一致。結(jié)果表明，天然復(fù)合防腐劑的復(fù)配使用，能有效的提高防腐保鮮效果，降低各防腐劑的用量；而一般的化學(xué)防腐劑由于安全性的問(wèn)題越來(lái)越不受歡迎。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，將該配方的防腐劑用于冷卻肉保鮮，在保鮮期的第六天開(kāi)始，冷卻肉的感官性狀（顏色、氣味、組織狀態(tài)、粘性）、保水力（WHC）顯著提高，菌落總數(shù)和TVB-N值顯著降低。說(shuō)明該混合物用于冷卻肉的防腐保鮮效果顯著，這也顯示了其重要的使用價(jià)值。

由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，防腐保鮮實(shí)驗(yàn)尚不夠完整，如能補(bǔ)充添加劑的毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)、并進(jìn)一步闡明各物質(zhì)的抗菌防腐機(jī)理，將有利于抗菌肽在食品防腐中的應(yīng)用推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]黨向利.家蠅蛹天然抗菌肽的制備及其分離純化研究.中山大學(xué)，2008.

[2]Hou LX，Shi YH，Zhai P，Le GW.2007b.Inhibition of foodborne pathogens from the larvae of the by Hf-1，a novel antibacterial peptide housefly （Musca domestica） in medium and orange juice. Food Control 18： 1350-1357.

[3]汪延生.家蠅種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及家蠅抗菌物質(zhì)在冷卻肉保鮮中的利用.中山大學(xué)，2009.

[4]宋萌，孔保華.Nisin 復(fù)合防腐劑對(duì)冷卻豬肉保質(zhì)期及品質(zhì)的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（10）： 82-88.

[5]馬美湖，婁愛(ài)華，葛長(zhǎng)榮等.冷卻肉生產(chǎn)中保鮮技術(shù)的研究——溶菌酶、Nisin、山梨酸鉀保鮮正交試驗(yàn).食品科學(xué)，2005， 26（3）： 235-243.