摘要：本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，建立了轉(zhuǎn)科豐6號(hào)和克螟稻基因大米成分的快速檢測(cè)方法。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)查閱的科豐6號(hào)和克螟稻引物信息，確立了轉(zhuǎn)科豐6號(hào)和克螟稻基因大米快速檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性、靈敏度和PCR擴(kuò)增效率進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明本研究建立的方法具有良好的特異性和PCR擴(kuò)增效率，靈敏度可達(dá)到0.01%。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因大米 科豐6號(hào) 克螟稻 檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2013）18-0012-04

由于轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)展，轉(zhuǎn)基因作物不但廣泛進(jìn)入食品市場(chǎng)，而且已成為飼料行業(yè)的主要原料來源[1]。然而，基因工程掌握的不確定性及不可預(yù)測(cè)性，使得轉(zhuǎn)基因食品安全問題成為目前人類在發(fā)展過程中必須面對(duì)的一個(gè)棘手的環(huán)境問題[2]。各國(guó)政府紛紛出臺(tái)了一系列有關(guān)轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品的管理、規(guī)定和法規(guī)，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)注，標(biāo)明其是否為轉(zhuǎn)基因，讓消費(fèi)者選擇[3]。2002年我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，規(guī)定對(duì)5大類17種產(chǎn)品必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)[4]。

大米是我國(guó)主糧，我國(guó)一直在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻研究，但一直沒批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化種植。多年來我國(guó)出口大米及其制品一直受到轉(zhuǎn)基因問題困擾，嚴(yán)重影響我國(guó)出口大米及其制品正常貿(mào)易[5-6]。2011年12月23日，歐盟官方公報(bào)發(fā)布了2011/884/EU號(hào)執(zhí)行決議替代2008/289/EC號(hào)決議，將措施管轄的范圍擴(kuò)展到所有在中國(guó)米產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因品系，對(duì)中國(guó)米產(chǎn)品實(shí)施史上最為嚴(yán)苛的入境檢查。因此，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因大米快速靈敏的檢測(cè)方法有組織、有針對(duì)性的開展對(duì)轉(zhuǎn)基因大米樣品的檢測(cè)和監(jiān)控顯的愈發(fā)重要，為有關(guān)部門提供監(jiān)管和行政執(zhí)法的科學(xué)依據(jù)、幫助食品出口企業(yè)突破貿(mào)易壁壘等都具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器

高速冷凍離心機(jī)3K18型，德國(guó)Sigma公司；超純水處理器Milli-Qplus，法國(guó)產(chǎn)；梯度PCR儀MyCyclerTM，美國(guó)Bio-RAD公司；電泳儀POWER Pac300，美國(guó)Bio-RAD公司；凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)2000型，美國(guó)Bio-RAD公司；恒溫?fù)u床，Orbital shaker，Thermo Forma，美國(guó)產(chǎn)；7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。

1.2 材料和試劑

CTAB提取緩沖液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，20mmol/L NaR2REDTA，pH8.0）；CTAB沉淀緩沖液（5g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl）；TE緩沖液：Tris 0.01mol/L，Na2EDTA0.001mol/L，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0；稀釋液：Waters-DEPC treated，上海生工；蛋白酶K：20mg/mL；NaCl溶液，1.2mol/L；無水乙醇、氯仿、異丙醇等有機(jī)試劑；熒光定量PCR試劑盒：TaKaRa Premix Ex Taq2×；樣品來源：本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)留樣。待測(cè)式樣見表1，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。

1.3 引物

根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)查閱的KF6（科豐6號(hào)）和KMD（克螟稻）的引物信息[7-8]，見表2。

1.4 檢測(cè)步驟

1.4.1 樣品制備

（1）取一定重量的檢驗(yàn)樣品，具體重量按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行[7-19]，放到干燥潔凈的研磨器中充分研磨約10分鐘，樣品呈粉末狀為佳。

*研磨器不能連續(xù)運(yùn)行超過1分鐘，中間需暫停，取出轉(zhuǎn)子搖勻樣品，再研磨。

（2）取大約1g研磨好呈粉末狀的其他樣品加入到15ml離心管中，做好標(biāo)記，另取約1g陰性樣品作為提取對(duì)照。

*取樣盡量取最細(xì)的。

1.4.2 DNA提取

（1）在制備好的樣品中加入5mL CTAB提取緩沖液（可加20μL蛋白酶K溶液，水浴65℃孵化1h（檢查樣品材料是否膨脹，樣品應(yīng)只有懸浮在液體中，如材料膨脹，再加入CTAB提取緩沖液，每次1mL）。

（2）孵育過夜。

（3）常溫離心12000rpm，10min直至懸浮部分幾近清澈（注意不能使用冷凍，因?yàn)槔鋬鍪共糠諨NA沉淀）。

（4）將1mL的上清液轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，加入700μL氯仿，高速渦旋震蕩混合30s。

（5）常溫12000rpm，10min，收集600-650μL上清，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的2mL離心管，加入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液。

（6）室溫（20℃～24℃）孵化60min，12000rpm離心10min。棄上清，將沉淀溶于350μL，1.2mol/L NaCl溶液。加入350μL氯仿，高速渦旋震蕩30s，混勻。

（7）12000rpm離心15min，小心將上清轉(zhuǎn)移至新的反應(yīng)管中，加入0.8倍體積的異丙醇，室溫（20℃～24℃）孵化至少20min。

（8）12000rpm離心10min，棄上清。加入500μL，70%乙醇洗滌沉淀，小心高速渦旋震蕩約30s，12000rpm離心10min。

（9）棄上清，使沉淀干燥。（最好室溫條件下過夜；或60 ℃以下15 min～20 min，不能讓沉淀過干）。

（10）將DNA溶于100μL TE緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 PCR反應(yīng)

（1）陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照的設(shè)置。陰性對(duì)照以待測(cè)非轉(zhuǎn)基因食品的DNA為模板。陽性對(duì)照以采用含有待測(cè)基因序列的植物的DNA為模板，或采用含有待測(cè)基因序列的質(zhì)粒?？瞻讓?duì)照分別設(shè)DNA提取空白對(duì)照（以水或TE代替樣品）和PCR反應(yīng)的空白對(duì)照（以水或TE代替DNA模板）。

（2）PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系見表3。每個(gè)DNA樣品至少做2個(gè)平行管。加樣時(shí)應(yīng)使樣品DNA溶液完全加入反應(yīng)液中，不要粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。

（3）儀器設(shè)置。設(shè)定樣品名稱、報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的種類、熒光信號(hào)收集等。

（4）PCR反應(yīng)參數(shù)。

UNG酶消除殘留污染：120s，50℃

活化DNA合成酶/預(yù)變性：600s，95℃

PCR（45個(gè)循環(huán)）

變性：15s，95℃

退火/延伸/熒光信號(hào)收集：60s，60℃。

（5）PCR反應(yīng)運(yùn)行。按預(yù)先設(shè)定的樣品擺放順序?qū)CR反應(yīng)管依次擺放（上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器），開始運(yùn)行儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

1.4.4 閾值設(shè)定

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置熒光信號(hào)閾值，閾值設(shè)定原則依據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

1.4.5 質(zhì)量控制

空白對(duì)照：內(nèi)源基因和外源基因均無熒光增幅現(xiàn)象。

陰性對(duì)照：內(nèi)源基因有熒光增幅現(xiàn)象且Ct值小于或等于36，外源基因無熒光增幅現(xiàn)象。

陽性對(duì)照：內(nèi)源基因和外源基因均有熒光增幅現(xiàn)象，且Ct值小于或等于36。

1.4.6 結(jié)果判定

測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值等于40，判斷該樣品不含所檢的外源基因。

測(cè)試樣品外源基因Ct值小于或等于36，判斷該樣品含有所檢的外源基因。

測(cè)試樣品外源基因檢測(cè)Ct值在36～40之間，應(yīng)調(diào)整模板濃度，重做實(shí)時(shí)熒光PCR。

再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)Ct值仍小于40，則可判定為該樣品檢出×××基因。

再次擴(kuò)增后的外源基因檢測(cè)Ct值等于40，則可判定為該樣品未檢出×××基因。

1.5 特異性試驗(yàn)

樣品A1、D、E、A2重復(fù)提取3次DNA，將DNA樣品配制成10-20ng/uL濃度，取5uL用作PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)PCR反應(yīng)2個(gè)平行。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

提取樣品B1、C1、B2、C2的DNA，將DNA樣品配制成20ng/uL濃度，取5uL用作PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)PCR反應(yīng)20個(gè)平行。

1.7 PCR擴(kuò)增效率

將提供的含量1%轉(zhuǎn)基因大米KF6的DNA，連續(xù)4倍梯度稀釋，配制成濃度分別為20ng/uL，5ng/uL，1.25ng/uL，0.31ng/uL，0.08 ng/uL的轉(zhuǎn)基因基因組DNA溶液，分別記為R1、R2、R3、R4和R5，作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別取5uL DNA用作PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)模板DNA濃度和擴(kuò)增的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)PCR反應(yīng)3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

不同樣品PCR擴(kuò)增的結(jié)果見表4。樣品A中內(nèi)標(biāo)基因、結(jié)構(gòu)特異基因和KF6品系特異基因?yàn)殛栃?，其余為陰性；樣品D中內(nèi)標(biāo)基因?yàn)殛栃?，其余為陰性；樣品E中內(nèi)標(biāo)基因?yàn)殛栃?，其余為陰性；樣品F中內(nèi)標(biāo)基因、結(jié)構(gòu)特異基因和KM品系特異基因?yàn)殛栃裕溆酁殛幮?。以上結(jié)果說明，本項(xiàng)目的檢測(cè)方法對(duì)于KF6和KM成分的檢測(cè)也具有良好的特異性。

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)不同含量的B1、C1、B2、C2樣品的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果見表5，每個(gè)PCR反應(yīng)20個(gè)平行，結(jié)果顯示：B樣品的內(nèi)標(biāo)基因、結(jié)構(gòu)特異基因和品系特異基因20個(gè)平行均為陽性；C樣品的內(nèi)標(biāo)基因、結(jié)構(gòu)特異基因和品系特異基因20個(gè)平行均為陽性，表明該檢測(cè)方法用于水稻及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01%，且具有良好的重復(fù)性。

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR反應(yīng)效率及結(jié)果記錄見表6。

3 結(jié)語

所有的轉(zhuǎn)基因植物新品系必須通過安全性評(píng)價(jià)及田間試驗(yàn)才能被獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)。然而不可避免的有未獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)的品系混進(jìn)市場(chǎng)，或者由于田間試驗(yàn)時(shí)造成污染而得以繁殖。目前所檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植物包括了官方批準(zhǔn)的和未經(jīng)官方批準(zhǔn)的品系，而無論是何種品系，檢測(cè)方法只能在轉(zhuǎn)基因新品系被發(fā)現(xiàn)并且序列被公布后才能建立起來，并且對(duì)于未經(jīng)官方批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因品系，陽性樣品較難獲得，這也限制了很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)其檢測(cè)方法的研究。

目前國(guó)內(nèi)尚無任何一個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因大米被獲準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)，檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)中雖然有相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但標(biāo)準(zhǔn)方法只能對(duì)BT品系進(jìn)行篩選，并不能特異性檢出轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)和克螟稻品系，本課題研究的檢測(cè)體系針對(duì)這一點(diǎn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了擴(kuò)充。

本研究根據(jù)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)對(duì)食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)需要，查閱了國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，確立了非法轉(zhuǎn)基因食品快速檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性、靈敏度和PCR擴(kuò)增效率進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明其具有良好的特異性、靈敏度和PCR擴(kuò)增效率。研究結(jié)果對(duì)檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)開展轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)和監(jiān)控，幫助食品出口企業(yè)突破貿(mào)易壁壘等具有十分重要的意義。

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